Современные методы диагностики инфекционных заболеваний: детектирование микроорганизмов по структурным, генетически детерминированным жирным кислотам в объекте исследования с помощью метода газовой хроматографии масс-спектрометрии
Применяемые на сегодняшний день в клинической практике методы определения микроэкологического статуса организма человека, а также диагностики инфекций имеют определенные ограничения и недостатки.
Например, существенным недостатком классического бактериологического исследования, помимо дороговизны и длительности (7-10 дней), является невозможность оценить роль в инфекционно-воспалительном процессе некультивируемых микроорганизмов, прежде всего анаэробов, а также актинобактерий. Отсюда несовершенство тактики микробиологического исследования в клинической лаборатории. Нет возможности единого скрининга клинического материала, обеспечивающего проверку на наличие всех возможных возбудителей. Поэтому врач должен на основании других клинических показателей и анамнеза определить - какую группу микробов определять и каким методом: посев на грибы, на аэробы, анаэробы, на метаболиты, или предположить участие в инфекции специфических агентов - хламидий, вирусов, возбудителей туберкулеза, бруцеллеза, лямблиоза и других и обращаться в специализированные лаборатории. [50, 51].
Число неучтенных возбудителей при обследовании каждого больного составляет сотни видов, так как давно известно, что в организме человека и в окружающей среде присутствует около пятисот видов, способных вызвать инфекционных процесс или воспаление. Сам организм человека оказывается основным источником микробов, и в первую очередь анаэробов. Анаэробы - доминанты микробиоты человека. Их места обитания - плотные мукопептиды слизистых оболочек кишечника, дыхательных путей, урогенитального тракта и закрытых от прямого доступа кислорода компартментов кожи. Аэробы не характерны для таких мест обитания микроорганизмов.
Приведенные выше соображения объясняют малую информативность практики клинических бактериологических исследований. Выход из сложившейся ситуации виден либо в расширении и углублении процедуры обследований культурально-биохимическим методом с обязательным включением в постоянную практику анаэробов и актинобактерий с усовершенствованием техники отбора проб, либо внедрение новых технологий микробиологического анализа, лишенных недостатков, связанных с необходимостью получения биомассы живых микроорганизмов в искусственных условиях.
Известные молекулярно-биологические методы, при несомненных преимуществах - прямое определение возбудителя, высокие специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций, - имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки. [83].
Из всего вышесказанного вытекает очевидная востребованность в надежном количественном экспресс-методе диагностики дисбактериозов и определения возбудителей инфекции.
В этом отношении перспективен метод метод масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ), в основе которого лежит высокоточное определение в анализируемой пробе молекулярных маркеров микроорганизмов - высших жирных кислот, альдегидов, спиртов и стеролов, входящих в состав их клеточной стенки. Определение производится высокочувствительным и селективным методом газовой хроматографии - масс спектрометрии (ГХ-МС), позволяющим одновременно измерять более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале, крови, моче, биоптатах, пунктатах, мокроте, и других биологических жидкостях и тканях без предварительного посева на питательные среды или использования тестовых биохимических материалов. Для максимального исключения ручных операций разработан автоматический алгоритм анализа с помощью штатных программ ГХ-МС и собственной программы реконструкции микроэкологического статуса пациента, дисбактериоза и полимикробной инфекции по данным концентраций микробных маркеров, вычисляемых относительно внутреннего стандарта с изотопной меткой. Технология позволяет определять концентрацию более 50 микроорганизмов в клиническом материале через три часа после его поступления в лабораторию[101,102,103]
. В последние годы широко ведутся исследования по анализу микроорганизмов, по моделированию в газовой фазе химических реакций термолиза, фотолиза, превращений катализируемых кислотами и основаниями, по изучению каталитических процессов.
В этой связи уместно привести шутливое выражение одного из «отцов» органической масс- спектрометрии Фреда Мак-Лафферти: «Если химическую задачу нельзя решить с помощью масс-спектрометрии, ее вообще нельзя решить». Признанием важности масс-спектрометрии для развития современной науки стало присуждение в 2002 г. Нобелевской премии создателям методов электроспрея и MALDI-TOF-MS ДжонуФеннуи Коичи Танаке. [146, 23].
Особенности состава жирных кислот теперь используются наряду с другими параметрами в бактериальной таксономии (Определитель бактерий, 1997) и клинической бактериальной диагностике (Larsson, 1994; Вейант,1999) [192]
В России метод анализа микробных сообществ с помощью ГХ-МС в объектах окружающей среды был разработан доктором биологических наук Осиповым Г.А. на базе исследований ГосНИИ биологического приборостроения (1994г). К настоящему времени состав жирных кислот большинства микроорганизмов изучен, показана его воспроизводимость, доказана их родо- и видоспецифичность. Метод детектирования микроорганизмов по ЖК-маркерам сходен с генетическим анализом (ПЦР, определение последовательности нуклеотидов 16sPHK и пр.), поскольку состав жирных кислот детерминирован в ДНК и воспроизводится путем репликации участка генома транспортными РНК и последующего синтеза ЖК в митохондриях по матричным РНК. Другими словами, профиль ЖК так же консервативен, как и строение ДНК.[8, 83, 95, 136].]
По сравнению с традиционными методами бактериологического исследования использование метода МСММ позволяет значительно сократить время и стоимость исследования, минуя стадии культивирования микроорганизмов и тестовых ферментаций, которые особенно сложны и трудоемки для анаэробов. Метод позволяет определять маркерные вещества микроорганизмов экспрессно, за 2,5 часа в прямом анализе клинического материала, выявлять и количественно определять состав полимикробной инфекции или изменение микроэкологического статуса организма человека. Он легко поддается стандартизации, для его реализации используются доступные любым лабораториям химические реактивы. После приобретения прибора нет необходимости покупать дорогостоящие стандартные наборы реактивов, сред, картриджей, праймеров и других расходуемых материалов.
1.4.