Методы обследования
Обследование детей включало сбор общепринятых анамнестических и клинико-лабораторных данных. Анамнез собирали со слов родителей, а также изучали амбулаторные медицинские карты детей.
Особое внимание уделяли изучению семейного анамнеза, акушерского анамнеза матери и анамнеза жизни ребенка. Оценивали семейную отягощенность по различным заболеваниям, патологию внутриутробного и постнатального периодов, характер вскармливания на первом году жизни, анализировали особенности психо-моторного развития ребенка, аллергоанамнез, проведение профилактических прививок. Особое внимание обращали на сбор анамнеза по перенесенным заболеваниям, анализировали предшествующее лечение:характер проводимой терапии, частоту проведения курсов антибиотикотерапии и иммуномодулирующей терапии, их эффективность. При сборе социально-бытового анамнеза отмечали начало посещения детского коллектива, особенности микро- и макроэкологического окружения.
Всем детям, находившимся в стационаре, были проведены общий анализ крови, общий анализ мочи, исследование кала на кишечную группу (детям до 3 лет), исследование кала на яйца глистов и энтеробиоз (детям старше 3 лет). По показаниям проводили биохимический анализ крови, обследование на оппортунистические инфекции, определение иммунного статуса, инструментальные исследования (рентгенография органов грудной клетки, электрокардиография, эндоскопия носоглотки и др.).
При проведении лабораторных методов обследования мы использовали методы диагностики детей с ОСЛ (крупом) таким образом, чтобы можно было с позиций доказательной медицины установить ведущую роль вирусной и/или бактериальной этиологии заболевания, оценить форму тяжести и необходимости своевременного назначения этиотропной терапии.
С целью выявления этиологии заболевания были проведены бактериологические, вирусологические и масс-спектрометрические методы исследования.
С целью оценки наличия вирусно-бактериальной инфекции - определение С-реактивного белка. С целью оценки уровня интоксикации определяли лейкоцитарный (ЛИИ) и ядерный (ЯИИ) индексы интоксикации. С целью оценки патогенности возбудителя определяли стафилококковые энтеротоксиныПеречень выполненных исследований приведен в таблице 1.
Таблица 1
Методы исследований
| № | Исследование | Метод, реакция | N |
| 1 | Биоценоз ротоглотки | Культуральный | 326 |
| 2 | Биоценоз кишечника | Культуральный | 206 |
| 3 | Исследование состава микробных маркеров в слюне | Метод газовой хроматографии - масс- спектрометрии | 106 |
| 4 | Исследование состава микробных маркеров в крови | Метод газовой хроматографии - масс- спектрометрии | 106 |
| 5 | Определение энтеротоксинов стафилококков из чистой культуры стафилококков | Метод ИФА для индикации SEC | 10 |
| 6 | Вирусологическое обследование носоглоточных смывов | Метод ПЦР Метод ИФА Иммунохроматографический экспресс-тест | 106 24 43 |
| 8 | Определение лейкоцитарного индекса (ЛИИ) и ядерного индекса (ЯИИ) интоксикации по данным ОАК | 106 | |
| 10 | Определение С-реактивного белка | Радиальная иммунодиффузия | 48 |
Все применяемые методики являются общепринятыми, поэтому приводится сокращенный вариант метода исследования и его принципа.
Исследование биоценоза ротоглотки, кишечника
Стерильным тампоном собирался материал со слизистой ротоглотки и помещался в пробирку, содержащую 1 мл тиогликолевого бульона. Кал собирался в стерильный контейнер ложечкой.
Затем делали посевы на различные агары и среды. Посевы инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-24 часов и подсчитывали количество выросших колоний. При оценке выросших колоний
учитывалось их количество на чашках с максимальными разведениями исходного материала, что выражалось в колониеобразующих единицах на тампон (КОЕ/тампон). Для дополнительной идентификации делались посевы еще на пять селективных сред: эктон-энтерик агар, конго- агар, клебсиелёзный агар, цетилперединий хлорид агар (ЦПХ-агар) и висмутовый агар.
Исследование состава микробных маркеров в слюне, крови методом газовой хроматографии масс-спектрометрии
Кровь, слюну подвергали кислому метанолизу в 0,4 мл 1 М HCl в метаноле в течение одного часа при 80оС. В результате реакции метанолиза жирные кислоты, входящие в состав сложных липидов пробы освобождались в виде метиловых эфиров. Их двукратно экстрагировали 200 мкл гексана, высушивали и обрабатывали в 20 мкл ^О-бис(триметилсилил)- трифторацетамида в течение 15 мин при 80 °С для получения триметилсилильных эфиров гидрокси-кислот. Смесь эфиров в количестве 1 мкл вводили в инжектор ГХ-МС системы AT-5850/5973 Agillent Technologies (США). Для управления и обработки данных используют штатные программы прибора. Хроматографическое разделение пробы осуществляли на капиллярной колонке с метилсиликоновой привитой фазой HP-5ms Хьюлетт-Паккард. Площади пиков маркеров на масс-фрагментограммах интегрировали автоматически по заданной программе с использованием внутреннего стандарта - три-дейтерометилового эфира тридекановой кислоты. Затем эти данные вводили в программу расчета, подготовленную в электронных таблицах EXCEL. При составлении программы анализа, алгоритма идентификации и количественного расчета численности микроорганизмов руководствовались принципом ограниченности числа членов локального микробного сообщества, узнаваемости профиля ЖК микроорганизма как образа при компьютерной идентификации и принципом маркера в применении только к рассматриваемому сообществу
микроорганизмов (33, Osipov, Turova, 1997).
На основании известных данных о наиболее распространенных в органах человека микроорганизмов (Mannual, 1991) сформирована локальная база данных состава их жирных кислот, которая использована для выявления маркеров и составления расчетных формул. Для обоснования принадлежности маркеров конкретным микроорганизмам, а также выбора схемы вычисления их концентрации использована аргументация, опубликованная ранее (Осипов, Парфенов, 2003).Определение энтеротоксинов стафилококков из чистой культуры стафилококков методом ИФА для индикации SEC
Проводили оценку энтеротоксигенности культур S. aureus, выделенных из носоглоточных смывов. Выращивание культур стафилококков проводили на жидкой питательной среде Casman E.P. (1958) с использованием ферментативного гидролизата казеина в больших пробирках объемом 40-50 мл, в которые наливали по 8 мл питательной среды. Культивирование проводили на шуттель-аппарате при непрерывном встряхивании при 210 об/мин в течении 24 ч при 37С. После окончания культивирования удаление микробных клеток проводили центрифугированием при 10 тысяч об/мин в течение 15 мин. Определение стафилококковых энтеротоксинов в надосадочной жидкости осуществляли методом иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных тест-систем для индикации стафилококковых энтеротоксинов.
Вирусологическое обследование носоглоточных смывов
С целью детекции РНК/ДНК респираторных вирусов: гриппа типа А (H1N1, H3N2) и типа В, парагриппа, аденовирусов 1, 2, 3 типов, РС-вируса были исследованы носоглоточные смывы.
Забор материала осуществляли с помощью стерильного ватного тампона с последующим помещением его в пробирку со средой №199, содержащей антибиотики (пенициллин и стрептомицин). Доставка проб в лабораторию
осуществлялась в специальном контейнере с охлаждающими элементами. Носоглоточные смывы хранили при -70оС до исследования. После замораживания и оттаивания с целью разрушения эпителиоцитов, образцы центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин. Для приготовления РНК/ДНК-пробы использовали полученную надосадочную жидкость.
Для выделения РНК и ДНК вирусов применяли коммерческие тест- системы «Рибосорб» производства «Амплисенс» (г. Москва) в соответствии с инструкцией производителя.
ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология», г. Москва). Для амплификации использовали тест-системы ООО «Компания Биоком» (г. Москва). Режим амплификации включал следующие этапы: 1 цикл 95°С - 2 мин; 45 циклов 95°С - 20 сек, 58°С - 20 сек, 74°С - 40 сек; 1 цикл 74°С - 2 мин.
Продукты ПЦР анализировали методом горизонтального электрофореза в 1,7% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, с последующей визуализацией в ультрафиолетовом спектре.