Гистологическая характеристика области ожоговой раны в разные периоды наблюдения
Для характеристики регенеративных процессов в области ожоговой раны необходимо оценивать как результаты планиметрического исследования, так и микроскопическую картину. В рамках работы был проведен гистологический анализ образцов на 3, 7, 14 и 21 сутки после моделирования ожоговой раны.
Гистологическая характристика образцов кожных покровов на данных сроках регенерации ожоговой раны позволяет сформировать представления о воздействии модифицированных клеток на раневую поверхность, процессы воспаления, ангиогенеза, колллагеногенеза, фиброгенеза и т.д.Гистологическая характеристика области ожоговой раны на 3 сутки
У животных контрольной группы поверхность поврежденных участков кожи покрыта струпом - некротизированными элементами эпидермиса и дермы. В струпе можно различить остатки сальных желез и волосяных фолликулов (рисунок 27). Струп прочно спаян с дном раны. Гиподерма не повреждена. Характер повреждений указывает на ожог Шб степени. В дерме и гиподерме наблюдается полнокровие сосудов, выраженный отек, деструкция коллагеновых волокон (рисунок 28).
Рисунок 27 - Участок кожи крысы контрольной группы на 3 сутки. В струпе фрагменты волосяных фолликулов (указано стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 28 - Участок кожи крысы контрольной группы на 3 сутки. Деструкция коллагеновых волокон (указано стрелкой). Окраска по методу ВанГизона. Ув. 100.
У группы животных, которым в область ожоговой раны были введены немодифицированные моноциты, изменения аналогичны контролю. Струп прочно связан с дном раны. Следует отметить более выраженную гиперемию сосудов и отек дермы и гиподермы по сравнению с группой контроля. В гиподерме выявляется инфильтрат, состоящий преимущественно из сегментоядерных клеток, более выраженный на границе с поверхностной фасцией.
Отек и гиперемия в области гиподермы местами сочетается с диапедезом эритроцитов (рисунок 29).
Рисунок 29 - Участок кожи крысы на 3 сутки после введения
немодифицированных моноцитов. Гиперемия сосудов (1), отек (2), воспалительный инфильтрат (3). Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 100.
В группе животных, которым в область ожоговой раны вводили аденозин-модифицированные моноциты, изменения аналогичны контролю. Однако следует отметить более выраженный отек гиподермы и инфильтрацию на границе дермы и струпа. Сам струп не прочно связан с дном раны, в некоторых местах отделен (рисунок 30). Воспалительный инфильтрат образует четко определяющуюся демаркационную зону и представлен преимущественно гранулоцитарными лейкоцитами. Коллагеновые волокна в дне раны разрыхлены (рисунок 31).
Таким образом, анализ морфологических изменений в коже через 3 дня после термического воздействия указывает на ожог Шб-IV степени. Поврежденная и некротизированная часть кожи, подвергшаяся термическому воздействию (струп), включала в себя большую часть сальных желез и волосяных фолликулов и занимала, в большинстве случаев, 1A слоя дермы. Характер повреждений и тканевых реакций указывает на успешность моделирования термического ожога.
Рисунок 30 - Участок кожи крысы группы введения аденозин-
модифицированных моноцитов на 3 сутки. Отделение струпа (слева) демаркационным воспалительным валом (указано стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 31 - Участок кожи крысы группы введения аденозин-
модифицированных моноцитов на 3 сутки. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 200.
На 3 сутки во всех группах можно отметить отек и полнокровие сосудов дермы и гиподермы, но в группах введения модифицированных и немодифицированных моноцитов эти явления носят более выраженный характер.
В группе введения немодифицированных моноцитоввоспалительная инфильтрация присутствует только в гиподерме, в то время как в группе введения аденозин-модифицированных моноцитов инфильтрация наблюдается как на границе струпа и дна раны, так и в гиподерме, что может свидетельствовать о более высокой скорости демаркации зоны некроза от здоровых тканей.
Гистологическая картина в образцах ткани животных может быть объяснена функциональными особенностями вводимых клеток. Известно, что моноциты способны секретировать хемоаттрактанты, стимулирующие миграцию клеток в очаг воспаления. Увеличение инфильтрации в области ожоговой раны у животных, которым вводили аденозин-модифицированные моноциты, может быть связано с измененным цитокиновым профилем вводимых клеток. Так согласно данным исследования in vitro, стимулированные аденозином моноциты экспрессируют повышенные количества мРНК генов хемоаттрактантов (IL8, IP10), что может являться основой для усиления продукции этих цитокинов и активной миграции клеток в очаг воспаления (инфильтрации).
Гистологическая характеристика области ожоговой раны на 7 сутки
У животных контрольной группы по сравнению с предыдущим сроком можно отметить более выраженную инфильтрацию на границе дна раны и струпа. Наблюдается локальное отделение струпа от поверхности раны (рисунок 32). В гиподерме отмечается выраженная гиперемия, отек, диффузная воспалительная инфильтрация.
по
Рисунок 32 - Участок кожи крысы контрольной группы на 7 сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
У животных, которым в область ожога вводили немодифицированные моноциты, сохраняются отек и полнокровие дермы и гиподермы, однако они менее выражены, чем в предыдущий срок. На границе струпа и дна раны определяется инфильтрат (рисунок 33). У одного из животных хорошо визуализируется пласт плоскоэпителиальных клеток, который расположен под струпом и отделен от него слоем инфильтрата (рисунки 33, 34).
Нарастание эпителиальных клеток под струпом связано, вероятно, с миграцией пролиферирующего эпидермиса с краев раны.
Рисунок 33 - Участок кожи крысы после введения немодифицированных моноцитов на 7 сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 34 - Участок кожи крысы после введения ^модифицированных моноцитов на 7 сутки. Пласт многослойного плоского эпителия, лежащий под струпом (указано стрелкой) и отделенный воспалительным инфильтратом. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 100.
У животных, которым в область ожоговой раны вводили модифицированные аденозином моноциты, на 7 сутки выявлялись аналогичные контролю изменения. Тем не менее, необходимо отметить, что у животных данной группы струп был более прочно спаян с дном раны, а инфильтрация была менее выражена (рисунок 35). На поверхности струпа четко определялся эпидермис (рисунок 36), что может быть связано с нарастанием кератиноцитов из сохранившихся волосяных фолликулов.
Таким образом, на 7 сутки после воздействия у крыс с введенными вокруг раны моноцитами крови появляются признаки репарации эпидермиса - под струпом и над ним. Сам струп в области, прилегающей к эпидермису, пронизан редкими сосудами микроциркуляторного русла, выявляется инфильтрат, состоящий преимущественно из сегментоядерных клеток. Инфильтрат можно наблюдать также на границе струпа с дном раны (демаркационное воспаление) и в гиподерме. Отмечается полнокровие сосудов дермы и гиподермы. Инфильтрация и полнокровие сосудов носят более выраженный характер по сравнению с 3 сутками.
Рисунок 35 - Участок кожи крысы группы введения аденозин-
модифицированных моноцитов на 7 сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 36 - Участок кожи крысы группы введения аденозин-
модифицированных моноцитов на 7 сутки.
Эпидермис покрывает поверхность струпа (указано стрелкой). Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 200.Полученные результаты можно объяснить действием цитокинов, продуцируемых вводимыми моноцитами, которые способствуют усилению инфильтрации и развитию воспалительной реакции в зоне ожога.
Гистологическая характеристика области ожоговой раны на 14 сутки
У животных контрольной группы состояние раны находится на разных стадиях репарации. В ряде случаев струп непрочно связан с дном раны и определяется зона демаркации, у других - отсутствует основная его часть, в которой находились остатки волосяных фолликулов и сальных желез. В случае наличия остатков струпа под ним наблюдается слабая инфильтрация, а также слой грануляционной ткани (рисунок 37). На молодой соединительной ткани выявляется тонкий слой эпидермиса, либо покрывающий освободившуюся от некротических масс поверхность раны (рисунок 37), либо нарастающий под струпом (рисунок 38). По сравнению с 7 сутками у животных менее выражены гиперемия и отек дермы. В гиподерме выявлено большое количество фибробластов, моноцитов (макрофагов), тучных клеток (рисунок 38). Производные эпидермиса (волосяные фолликулы, сальные железы) не наблюдаются. Коллагеновые волокна в дерме и гиподерме преимущественно толстые, грубые (рисунок 38).
Рисунок 37 - Участок кожи крысы контрольной группы на 14 сутки. Грануляционная ткань под остатками струпа. Высокая клеточность и гиперемия гиподермы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 38 - Участок кожи крысы контрольной группы на 14 сутки. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 100.
У животных, которым вокруг ожоговой раны вводили немодифицированные моноциты, на 14 сутки струп непрочно связан с дном раны, в ряде случаев основная его часть отсутствует, и дно раны покрыто пластом уплощенных клеток, имеющих эпителиальное происхождение.
В подлежащий дерме выявляется грануляционная соединительная ткань (рисунок 39). В части препаратов струп покрывает рану (рисунок 40), но тоже отделяется от дермы грануляционной тканью. При окраске по Ван Гизону определяется неоднородный характер коллагенового матрикса дермы: толстые волокна вблизи струпа и нежные тонкие нити в сетчатой зоне (рисунок 40). Отек и гиперемия дермы и гиподермы по сравнению с 7 сутками у животных данной группы выражены незначительно.У животных, которым в область ожоговой раны вводили адензин- модифицированные моноциты, струп отсутствует. Дно раны выстлано грануляционной тканью и покрыто слоем уплощенных клеток (рисунок 41). Сосуды грануляционной соединительной ткани гиперемированы. В подлежащей дерме отмечается легкое полнокровие венозных сосудов, воспалительная инфильтрация отсутствует. Структура коллагеновых волокон дермы и гиподермы не изменена (рисунок 42).
Рисунок 39 - Участок кожи крысы на 14 сутки после введения немодифицированных моноцитов. Струп отсутствует, дно раны выстлано
соединительной тканью. Слабая гиперемия дермы и гиподермы. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Рисунок 40 - Участок кожи крысы на 14 сутки после введения немодифицированных моноцитов. Окраска по методу Ван Гизона. У в. 100.
Таким образом, на 14 сутки во всех экспериментальных группах отек и инфильтрация носят гораздо менее выраженный характер, что свидетельствует о пике воспалительной реакции в предыдущие сроки. На 14 сутки происходило отторжение струпа у части животных контрольной группы и группы введения немодифицированных моноцитов, в то время как в группе введения модифицированных моноцитов рана освободилась от некротических масс у всех крыс.
Рисунок 41 - Участок кожи крысы на 14 сутки после введения аденозин- модифицированных моноцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Рисунок 42 - Участок кожи крысы группы введения аденозин-
модифицированных моноцитов на 14 сутки. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 200.
Во всех экспериментальных группах наблюдалось развитие грануляционной соединительной ткани, которая выстилала рану или находилась непосредственно под струпом. Эпителизация раневой поверхности определялась не во всех случаях, чаще новообразованный эпидермис имел 1-2 - рядную форму пласта. Гистологические признаки ускоренной репарации, наблюдающиеся на 14 сутки эксперимента, могут свидетельствовать о благоприятном влиянии модифицированных аденозином моноцитов на течение воспалительной реакции, скорость санации раны от некротических масс.
Гистологическая характеристика области ожоговой раны на 21 сутки
У животных контрольной группы на 21 день наблюдения струп отсутствует, и поверхность дна раны покрыта зрелым эпидермисом, инфильтрированным гранулоцитами и мононуклеарами (рисунок 43). Следует отметить выраженную подэпителиальную гиперемию и сосудистые реакции в дерме и гиподерме, отек гиподермы. В подэпителиальной зоне определяется воспалительный инфильтрат преимущественно из мононуклеаров. Дериваты кожи (волосяные фолликулы, железы) отсутствуют или склерозированы. При окраске по Ван Гизону коллагеновый матрикс дермы не имеет каких-либо нарушений (рисунок 44).
Рисунок 43 - Участок кожи крысы контрольной группы на 21 сутки. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 100.
Рисунок 44 - Участок кожи крысы контрольной группы на 21 сутки. Окраска по методу Ван Гизона. У в. 100.
У животных, которым в область ожоговой раны вводили немодифицированные моноциты, на 21 сутки эксперимента поверхность кожи покрыта слоем эпидермиса, который состоит из типичных 5 слоев (рисунок 45). В эпидермисе инфильтрация не наблюдается, но под эпителием отмечается усиленная клеточная реакция из мононуклеаров и фибробластов. Отсутствует гиперемия и отек дермы и гиподермы. Коллагеновые волокна зрелые (рисунок 46). Производные кожи практически отсутствуют, встречаются единичные остатки волосяных фолликулов в глубоких слоях дермы.
Рисунок 45 - Участок кожи крысы на 21 сутки после введения
немодифицированных моноцитов. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.
Рисунок 46 - Участок кожи крысы на 21 сутки после введения немодифицированных моноцитов. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 100.
На препаратах кожи животных, которым вокруг ожоговой раны вводили аденозин-модифицированные моноциты, четко определяется эпидермис, который непрочно связан с дермой. Обращает на себя внимание большое количество волосяных фолликулов в дерме, многие из которых имеют признаки гиперплазии кератиноцитов (рисунок 47). Отек и гиперемия отсутствуют. Коллагеновые волокна, определяющиеся при окраске по Ван Гизону, в подэпителиальной зоне - нежные и тонкие, а в дерме образуют пучки зрелых, интенсивно окрашенных и разнонаправленных нитей (рисунок 48).
Рисунок 47 - Участок кожи крысы на 21 сутки после введения аденозин- модифицированных моноцитов. Сохранившиеся волосяные фолликулы с признаками гиперплазии кератиноцитов (указано стрелкой). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.
Рисунок 48 - Участок кожи крысы на 21 сутки после введения аденозин- модифицированных моноцитов. Окраска по методу Ван Гизона. Ув. 400.
Таким образом, на 21 сутки эксперимента у всех животных отмечаются признаки репарации эпидермиса в области ожоговой раны. В контрольной группе эпидермис инфильтрирован сегментоядерными лейкоцитами, наблюдается полнокровие сосудов дермы и гиподермы, отек, что может указывать на воспаление, присоединившееся в ходе заживления. В группах введения вокруг раны моноцитов можно наблюдать сформировавшийся эпидермис, как правило, обычного строения. Однако в группе введения аденозин-модифицированных моноцитов эпидермис связан с дермой не прочно, подэпителиально определяется слой рыхло расположенных коллагеновых волокон, имитирующий сосочковый слой кожи. Примечательно, что только в этой экспериментальной группе в дерме сохраняются волосяные фолликулы, что можно трактовать как восстановление структуры дермы со всеми ее производными. Отсутствие каких-либо сосудистых реакций и инфильтрата после введения немодифицированных и аденозин-модифицированных моноцитов позволяет говорить о нормальном ходе процесса заживления.
Наблюдаемый нами практически полноценный процесс репарации после введения модифицированных моноцитов может быть связан с повышенным уровнем секреции цитокинов (VEGF, |3FGF, IL-I (3, IL-6, IL-8), стимулирующих все процессы, обеспечивающие структурное
восстановление: ангио-, фибро-, коллагеногенез и эпителизацию.
Необходимо также отметить, что модифицированные аденозином моноцитоы секретируют также факторы (IP-10), лимитирующие данные процессы, предотвращая тем самым избыточный и нефизиологичный рост составляющих кожного покрова и образование рубцов.