Анализ иммунофенотипа моноцитов человека методом проточной цитофлуориметрии
Исследование экспрессии поверхностных кластеров дифференцировки проводили методом проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson, США).
Определяли уровень экспрессии CDla - молекулы, обнаруживаемой на дендритных клетках миелоидного происхождения (FITC, «BD Biosciences», США); CD 14 - маркера моноцитов (РЕ, «BD Biosciences», США); CD 209 (PerCp-Cy5.5, «BD Biosciences», США) - маркера дендритных клеток.При пробоподготовке моноциты после культивирования окрашивали флуорохром-конъюгированными моноклональными антителами. Из культуральных плашек клетки переносили в пробирки для проточной цитофлуориметрии (Falcon, «BD Biosciences», США). Пробы центрифугировали с ускорением IlOOg в течение 5 минут при 4°С. Далее клетки (0,5 млн клеток в 100 мкл буфера) инкубировали с флуорохром- конъюгированными моноклональными антителами к CDla, CD 14, CD209 из расчета 1,0 мкг/мл в течение 20 минут на холоде (4° С). По окончании инкубации промывали 2,0 мл буфера от несвязавшихся антител и центрифугировали с ускорением 490g в течение 5 минут при 4°С. После деконтации добавляли по 400 мкл буфера в каждую пробирку, перемешивали и анализировали на проточном цитофлуориметре в течение часа после окрашивания. Для анализа использовали не менее 10000 клеток каждого образца.
2.3.3