ВНУТРИВИДОВАЯ СТРУКТУРА ЧЕРНОМОРСКО - КАСПИЙСКОЙ ТЮЛЬКИ
CLUPEONELLA CULTRIVENTRIS (NORDMANN, 1840) ПО РЕЗУЛЬТАТАМ АЛЛОЗИМНОЙ И RAPD- ИЗМЕНЧИВОСТИ
В.В. Столбунова, Д.П. Карабанов
Учреждение Российской академии наук Институт биологии внутренних вод
им.
И.Д.Папанина РАН, Борок, Ярославская обл., Россия е- mail: vvsto@mail.ruВопрос о таксономическом статусе и степени внутривидовой подразделенности черноморско
- каспийской тюльки до настоящего времени остается дискуссионным. У черноморско- каспийской тюльки Clupeonella cultriventris (ранее - C. delicatula) в связи с большим географическим ареалом выделяли 4 подвида: черноморская тюлька C. delicatula delicatula, каспийская тюлька C. delicatula caspia, азовская тюлька C. delicatula azovi и чархальская тюлька C. delicatula tscharchalensis (Владимиров, 1950; Световидов, 1952). По данным традиционного морфологического анализа азово-черноморские и каспийские популяции неоднократно переписывались то в статусе единого вида, то в статусе двух подвидов (Световидов,1964; Атлас, 2002; Богуцкая, Насека,2004). После создания водохранилищ почти на всем протяжении Волги тюлька за короткий исторический период (порядка 40-50 лет) самостоятельно расселилась по всем водохранилищам каскада, а также по водохранилищам р. Камы и р. Шексна. При этом, фактически с момента первого обнаружения тюльки в волжских водохранилищах, встал вопрос об источнике ее происхождения - из азово-донской или же из каспийской популяции.
Для определения степени внутривидовой подразделенности и уточнения таксономического статуса тюльки в бассейнах Черного, Азовского и Каспийского морей был осуществлен популяционно-генетический анализ ряда крупных групп популяций с применением методов диск-электрофореза белков в полиакриалмидном геле (PAGE) и полимеразной цепной реакции со случайными праймерами (RAPD-PCR).
RAPD - маркеры локализованы в основном в некодирующей области ДНК, скорость мутирования ее вдвое выше, чем в кодирующей области, которая составляет всего 1% генома, показателем полиморфизма которой является аллозимная изменчивость.
Используемые методы дополняют друг друга и позволяют исследовать геном в целом.Для анализа аллозимной изменчивости использовали выборки в размере 40 экземпляров из популяций: Сев. Каспия, 2 - Волгоградского вдхр., 3 - Горьковского вдхр., Рыбинского вдхр., Азовского м., Днестровского лим., р. Днепр, р. Маныч, C. engrauliformes (Каспийского м.). Живую рыбу фиксировали жидким азотом в сосудах Дьюара СК-50, либо замораживали при температуре не выше -27°С. В лабораторных условиях отбирали образцы для генетического исследования. Разделение и гистохимическое выявление аллозимов проводилось в соответствии со стандарными методиками (Глазко, 1988; Walker, 2002). В качестве основных изучаемых ферментов использовались: a-глицерофосфат дегидрогеназа (E.C. 1.1.1.8), лактатдегидрогеназа (E.C. 1.1.1.27), малатдегидрогеназа NAD-зависимая (E.C. 1.1.1.37), малатдегидрогеназа NADP-зависимая (E.C. 1.1.1.40), 6-фосфоглюконат дегидрогеназа (E.C. 1.1.1.44), глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа (E.C. 1.1.1.49), супероксиддисмутаза (E.C. 1.15.1.1), аспартатаминотрансфераза (E.C. 2.6.1.1); щелочная фосфатаза (E.C. 3.1.3.1), эстеразы эфиров карбоновых кислот: 2-нафтилацетат зависимая эстераза и D-эстераза (E.C. 3.1.1.x) и спектр общего белка (GP, miog.). При разделении ферментов применялись вертикальные электрофоретические камеры с пластинами PAG, при этом одновременно исследовалось 40 образцов в блоке.
RAPD-изменчивость изучали в выборках тюльки из популяций Северного Каспия (приустьевой участок р.Сулак), Пролетарского водохранилища р. Маныч, Азовского моря (у п.Чумбур - Коса) и Рыбинского водохранилища р. Волга. Исследовано 4 выборки по 10 особей в каждой. Выделение тотальной ДНК проводили из мышечной ткани с помощью набора реагентов Diatom DNA Prep 100. Для выявления геномной вариабильности использовали семь случайных праймеров следующего состава: ОРА11, OPA17; OPA19; R55; P29; OPA20; SB2. ПЦР проводили на амплификаторе ТП4-ПЦР-01 (ДНК-Технология). Программа амплификации включала в себя этап первоначальной денатурации ДНК - 5 мин., +94°С; затем 35 циклов синтеза фрагментов ДНК : денатурация -94°С в течение 2 мин, отжиг - 45°С - 1 мин, элонгация - 72°С - 2 мин.
После завершения программы температура снижалась до 4°С. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводилось в 1,5% агарозном геле толщиной 7 мм, в течение 8 часов. Агарозные гели, окрашенные бромистым этидием, просматривали в УФ с длиной волны λ=312 нм и фотографировали цифровой камерой фирмы Olympus С-2100 Ultra Zoom. Изображения заносили в компьютерную базу данных. В качестве маркеров молекулярной массы использовали 100 bp, 50 bp и 1kb Ladder (Fermentas). Денситометрический анализ активности изоферментов проводили по индивидуальным электрофоретическим трекам с использованием пакета RFLPscan Plus v.3.12 (CSP, Inc.). Популяционно-генетический анализ проводился с использованием программы BIOSYS r.1.7 и TREECON (Van der Peer,1994). Статистический анализ и графическое представление материалов проводилось в программе STATISTICA v.7 (StatSoft, Іпс.).Для определения таксономического статуса была проведена UPGMA-кластеризация крупных групп популяций тюльки из разных бассейнов на основании дистанций Нэя (Nei, 1972), с использованием в качестве репера данных по каспийской популяции анчоусовидной тюльки C. engrauliformes.Результаты по аллозимной изменчивости свидетельствуют, что на всем протяжении своего современного ареала черноморско-каспийская тюлька представляет собой генетически единую совокупность популяций Clupeonella cultriventris in sensu lato, надежно дифференцированную от родственного вида - анчоусовидной тюльки (рис. 1). Значимых генетических различий межвидового уровня (по классификации Ayala, 1975) между азово-черноморской, каспийской и манычской тюлькой не наблюдается (дистанция 0,036), тогда как между черноморско-каспийской и анчоусовидной тюлькой различия достигают величины генетической дистанции 0,69, что может характеризовать их как надежные таксономические виды.
С помощью семи случайных праймеров было выявлено 148 локусов, из них 20 - видоспецифичных мономорфных локуса, общих для четырех популяций. Уровень полиморфизма составил 85.0%.
Внутри каждой из четырех выборок доля полиморфных локусов составила: 74.0% (Азовское море), 69.0% (Северный Каспий), 70.0% (р.Маныч), 68.0% ( Рыбинское в-ще). При анализе установлено, что выборка из района Северного Каспия наиболее гетерогенна и достоверно отличается (р< 0,05) от других популяций по среднему числу RAPD-фрагментов (70,6±2,3), тогда как выборки из р. Маныч, Азовского моря и р. Волга не различаются между собой по этому показателю (60,0±1,4; 61,6±2,6; 61,5±2,3, соответственно). По данным RAPD- анализа отмечено совпадение мономорфных видоспецифичных RAPD-фрагментов у представителей всех выборок, что говорит о значительном сходстве геномов исследуемых особей. При исследовании генетических расстояний (рис.2.), несмотря на столь отчетливую кластеризацию, индекс бутстрепа даже по основным кластерам свидетельствует о слабой надежности обьединений (3235%), что также свидетельствует о таксономическом видовом единстве тюльки этих популяций и что внутривидовая дивергенция тюльки двух рассматриваемых морских бассейнов, по всей видимости, не достигает даже статуса подвидов. Не исключено, что формирование этих субкластеров вызвано обитанием тюльки в водоёмах с различной степенью минерализации. Отсутствие различий пресноводных популяций Днепра в сравнении с лиманными черноморскими популяциями, вероятно, может быть объяснено исторической молодостью этих пресноводных групп, в которых изменения частот аллелей ещё не достигли существенных значений. С другой стороны, последовательность формирования внутривидовых кластеров и их четкая географическая детерминированность позволяет с уверенностью говорить, во-первых, о более ранней в палеонтологическом масштабе времени дивергенции азовских и каспийских популяций, а во-вторых, о несомненном происхождении волжских и манычских популяций из каспийских.
Рис.1. Иерархическая структура основных географических групп популяций C.
cultriventris с реперным видом C. engrauliformes на основании популяционно-генетического анализа 12 локусов. Результат иерархической кластеризации (UPGMA) на основании генетических дистанций Нэя (Nei, 1972, 1975). Популяции: 1- Сев. Каспий, 2- Волгоградское вдхр., 3- Горьковское вдхр., 4- Рыбинское вдхр., 5- Азовское м., 6- Днестровский лим., 7- р. Днепр, 8- Маныч, 9- C. engrauliformes (Каспийское м.).
Рис. 2. Дендрограмма генетического сходства между популяциями различных частей ареала C. cultriventris. Результат иерархической кластеризации (UPGMA) на основании генетических дистанций Нэя (Nei, 1978), в
узлах ветвления указан индекс бутстрепа. Популяции: р. Маныч, Пролетарское вдхр. (особи 1-10); р. Волга, Рыбинское вдхр. (11-20); Сев. Каспий, р.н- устья р. Сулак (21-30); Азовское м., Чумбур-Коса (31-40).
Впервые генетическими методами показано, что черноморско-каспийская тюлька является генетически единым таксономически валидным видом. Выделение независимых таксонов внутри вида Clupeonella cultriventris sensu lato не подтверждается генетическими исследованиями. На внутривидовом уровне тюлька подразделяется на две популяционные группы - Черноморско-Днепровско- Азово-Каспийскую и Волго-Манычскую.
Литература
Аннотированный каталог круглоротых и рыб континентальных вод России. Ред. Решетников Ю.С. М.: Наука, 1998. 220 с.
Богуцкая Н.Г., Насека А.М. Каталог бесчелюстных и рыб пресных и солоноватых вод России с номенклатурными и таксономическими комментариями. М.: КМК, 2004. 389 с.
Владимиров В.И. О систематическом положении азовской и черноморской тюльки Clupeonella delicatula (Nordmann) // ДАН СССР. 1950. Т.70. №1. С. 125-128.
Глазко В.И. Генетика изоферментов сельскохозяйственных животных. Итоги науки и техн. ВИНИТИ, 1988. Сер. Общ. генетика. - 212 с.
Световидов А.Н. Сельдёвые (Clupeidae). Фауна СССР. Рыбы. Т.2. Вып.1. М. -Л.: Изд. АН СССР, 1952.
333с.Van der Peer Y., De Wachter. R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment// Comput. Applic. Biosci. 1994. V. 10. P.569-570.
INTRASPECIFIC STRUCTURE BLACK SEA AND CASPIAN KILKA (CLUPEONELLA CULTRIVENTRIS) OF THE (NORDMANN, 1840) BY RESULTS OF ALLOZYME AND RAPD- VARIABILITY V.V. Stolbunova, D.P. Karabanov
Papanin Institute for Biology of Inland Waters RAS, Borok, Yaroslavl Reg., Russia e-mail: vvsto@mail.ru
For definition of a degree intraspecific differentiation and specifications the taxonomical status kilka in pools of the Black, Azov and Caspian seas have been carried out the population-genetic analysis of some large groups of populations with application of methods a disk - electrophoresis of protein in polyacrylamide gel (PAGE) and polymerase chain reaction with random markers(RAPD-PCR). Data obtained both on izopherment composition & RAPD-markers allow to suppose that Caspian Sea and Azov- Black Sea basin kilka is differentiated on the population level and doesn't reach taxonomical status of subspecies