ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ РАЗЛИЧНОЙ УГЛЕВОДНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ НА ГЕМОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ГЕМОЦИТОВ МИДИИ MYTILUS EDULIS
А.Н. Сухачев 1,2, И.В. Кудрявцев 1,2, К.Е. Николаев 3, К.В. Галактионов 3,
А.Д. Харазова 2, А.В. Полевщиков 1
1 ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, г.
Санкт-Петербург, Россия 2 Санкт-Петербургский государственный университет, г. Санкт-Петербург,3 Зоологический институт РАН, г. Санкт-Петербург
e-mail: ovechka21@yandex.ru
Распознавание углеводных детерминант на поверхности патогена играет важную роль в системе защитных реакций врожденного иммунитета различных групп животных. В настоящее время углевод-распознающие рецепторы, равно как и скевенджер- и толл-подобные рецепторы, относятся к группе паттерн- распознающих молекул, которые связываются со специфическими молекулярными паттернами (известными как ассоциированные с патогенами молекулярные паттерны или ПАМП) определенных микроорганизмов. Результатом подобного рода взаимодействий является активация клеточных и гуморальных эффекторных систем, направленных на элиминацию патогена из внутренней среды организма. У беспозвоночных основная функциональная нагрузка по распознаванию и уничтожению патогена приходится на циркулирующие клетки гемолимфы - гемоциты. Гемоциты различных представителей моллюсков несут на своей поверхности широкой спектр угле- вод-распознающих рецепторов, которые играют ведущую роль в распознавании микроорганизмов и многоклеточных паразитов (Castillo, Yoshino, 2002). Взаимодействие рецепторов со специфическими лигандами приводит к активации циркулирующих клеток, их направленной миграции в место проникновения патогена и запуску процесса фагоцитоза. В результате происходит уничтожение , посредством кислород зависимых и кислород независимых механизмов. Если углевод-связываю- щие молекулы имеют сывороточную локализацию, то они могут повышать эффективность фагоцитоза, выполняя функции опсонинов.
В рамках исследования взаимоотношений паразит-хозяин на примере модели Biomphalaria
glabrata - трематода Schistosoma mansoni было показано, что ключевое начение в распознавании гемоцитами моллюска спороцист S. mansoni играют именно белок-углеводные взаимодействия (Boswell, Bayne, 1986). При этом данные молекулы могут иметь как клеточную, так и сывороточную локализацию. Растворимые лектины гемолимфы, сходные по своей углеводной специфичности с ConA, ECA, SBA, TPA и WGA, были обнаружены в гемолимфе моллюска B. glabrata (Johnston, Yoshino, 1996). При этом полученные лектины обладали способностью связываться с гликопротеинами и гликолипидами, выделенными с поверхности тегумента спороцист S. mansoni. Следует отметить, что система B. glabrata - S. mansoni является крайне сложной для проведения сравнительно-иммунологических исследований., Весьма перспективными для выполнения такого рода работ служат системы моллюски-трематоды, в которых моллюск играет роль второго промежуточного хозяина. К таким системам относится выбранная нами модель двустворчатые моллюски Mytilus edulis - метацеркарии Himasthla elongata, некоторые результаты изучения которой приведены в настоящем сообщении.
Материалы и методы
Объектом исследования стали мидии Mytilus edulis, собранные в июле 2008 г. районе Беломорской Биологической Станции «Картеш» им. О.А. Скарлато Зоологического института РАН. В экспериментах было использовано более 60 животных возраста 4-6 лет. Гемолимфу с клетками получали в туберкулиновый шприц из заднего аддуктора моллюска и консервировали 5% (по объему) 0,3 М раствора ЭДТА на фильтрованной морской воде (ФМВ). Клетки отделяли от гемолимфы центрифугированием (7 мин при 200g) и отмывали от ЭДТА модифицированным раствором Дальбекко без Ca2+ и Mg2+, содержавшим 25 г/л NaCl. При исследовании гуморальных факторов раствор ЭДТА к образцам гемолимфы не добавляли, центрифугирование проводили при аналогичных условиях.
Для изучения гемолитической активности безклеточной гемолимфы и циркулирующих клеток M.
edulis в качестве клеток-мишеней использовались как интактные, так и опсонизированные различными лектинами эритроциты человека (ЭЧ). В рамках данной работы были использованы следующие лектины: лектин арахиса (PNA, специфичный к PDGai, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), лектин завязей пшеницы (WGA, специфичный к NAcaDGlc, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), конканавалин А (ConA, специфичный к aDMan, (Sigma, USA)), лектин улитки (HPA, специфичный к NAcaDGal, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), фитогемагглютинин (PHA, специфичный к NAcaDGal, Sigma, USA), лектин сои (SBA, специфичный к NAcDGal, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), лектин гороха (PSA, специфичный к aDMan, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), лектин бузины черной, (SNA, специфичный mNAcNANA (2^6) Gal/NAcGal, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), лектин картофеля (STA, специфичный к NAcGlc3, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина), лектин чечевицы (LCA, специфичный к a-Man, Львовский НИИ гематологии и переливания крови, Украина). ЭЧ опсонизировались лектинами в субагглютинирующих концентрациях, после чего трижды отмывались избытком ФР (7-10 мин при 200g). Для постановки реакции гемагглютинации и гемолиза, методика проведения которых описана ниже, использовалась 1% суспензия ЭЧ, а для оценки гемолитической активности циркулирующих клеток Mytilus edulis - 4% суспензия ЭЧ в изотоноическом растворе.Титры гемагглютининов оценивали в реакции гемагглютинации (РГА) по общепринятой методике. РГА осуществляли в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических реакций («Медполимер», Санкт-Петербург), заполняя лунки 50 мкл ФР. Серийные двукратные разведения исследуемых образцов гемолимфы готовили 8-канальной цифровой пипеткой («Ленпипет», Санкт-Петербург), перенося из лунки в лунку по 50 мкл серийных разведений индивидуальных образцов гемолимфы. Рабочую 1% суспензию ЭЧ добавляли в лунки по 25 мкл.
Для оценки уровней агглютинирующих факторов планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1.,5 -2 ч. Реакцию оценивали визуально. Результат реакции выражали в виде титра, равного -1од2Х, где Х - последнее разведение гемолимфы, обеспечивавшее формирование типичного агглютината. Гемолитическую активность гемолимфы определяли с помощью реакции гемолиза. Реакцию оценивали визуально через 3 ч после начала РГА. Результат также выражали в виде титра, равного -1од2Х, где Х - последнее разведение гемолимфы, при котором наблюдался выход гемоглобина из ЭЧ в раствор.Для изучения гемолитической активности циркулирующих клеток Mytilus edulis был использован метод, являющийся безгелевой модификацией реакции локального гемолиза по Н.К. Ерне. Гемоциты переводили в полную культуральную среду на основе RPMI-1640 с содержанием 24 г/л NaCl, 10 мМ HEPES, 2% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глютамина и 100 мкг/мл пенициллина и 100 Ед/мл стрептомицина (все реактивы - «ПанЭко», Россия), устанавливая концентрацию гемоцитов равной 60 тыс. клеток в 1 мл среды. Клеточную суспензию вносили в 96-луноч- ный планшет (Sarstedt) по 200 мкл, и добавляли 25 мкл 4%-ной суспензии интактных, предобработанных лектинами или десиализированных ЭЧ. После 3 ч инкубации при 10°С образцы центрифугировали (10 мин при 200g), и в надосадках оценивали выход гемоглобина из ЭЧ по оптической плотности (ОП, λ=405 нм) на многоканальном спектрофотометре ПИКОН (Москва). Параллельно исследовалась способность гемоцитов, предобработанных лектинами, к лизису нативных ЭЧ. Для этого в культуры клеток вносили растворы лектинов в субагглютинирующих концентрациях, полученных в предыдущих работах, инкубировали 60 мин. при температуре соответствующей температуре морской воды в это время года, после чего добавляли 25 мкл 4%-ной суспензии клеток-мишеней. Для десиализации ЭЧ использовали 1% раствор трипсина на физиологическом растворе, который перед использованием был подогрет до 37° С, pH стабилизировали путем добавления 100 мкл 1М HEPES.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакетов программ Exce1 и STATISTICA 5.0. Итоговые результаты экспериментов выражали в форме средней арифметической и ее ошибки. Для определения статистически значимых различий между независимыми группами нормально распределённых данных использовали t-критерий Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Применение лектинов для решения основных проблем фундаментальной и сравнительной иммунологии, вирусологии и клеточной биологии является одним из перспективных методологических подходов. Лектины тесно связаны с исследованием структуры и функций клеточных мембран, что находит широкое применение в рамках исследования защитных реакций различных представителей беспозвоночных. В ходе серии собственных экспериментов была предпринята попытка оценить влияния лектинов с различной углеводной специфичностью на функциональную активность как циркулирующих клеток, так и белков гемолимфы на примере гемагглютининов и гемолизинов (см. таблица).
В литературе описано несколько способов взаимодействия лектинов и гемоцитов моллюсков (Fryer et a1., 1996). Во-первых, это непосредственное связывание углевод-распознающих структур гемоцитов с лигандами на поверхности патогена. Во-вторых, лектины, входящие или искусственно введенные в состав покровов модельных частиц (например, ЭЧ), взаимодействуют со специфическими углеводными структурами на поверхности гемоцитов, результатом чего является активация клеток. И, наконец, растворимые лектины гемолимфы могут полимеризоваться с образованием сложных комплексов, тем самым, вызывая агглютинацию эритроцитов. В рамках собственных экспериментов второй подход был реализован для исследования клеточных реакций врожденного иммунитета, а третий подход - для изучения гуморальных факторов гемолимфы M. edulis.
При исследовании цитолитической активности гемоцитов мидии M. edulis было установлено, что лектины, обладающие способность специфически связываться с терминальными углеводами NAcG1c (лектины картофеля и завязей пшеницы) и NAcGa1 (лектины сои, бузины черной и улитки), повышают эффективность распознавания гемоцитами эритроцитов человека (см.
таблица). Взаимодействие с лектинами приводит к активации гемоцитов, что сопровождается дегрануляцией и высвобождением в окружающую среду широкого спектра лизосомальных ферментов, в том числе кислой и щелочной фосфатазы, β-гликозидазы, аминопептидазы, различных протеаз и липаз (Carballal et al., 1997), что, в конечном итоге, приводит к лизису эритроцитов.Данные литературы также свидетельствуют о ведущей роли углевод-распознающих рецепторов циркулирующих клеток моллюсков в процессах распознавания и элиминации патогена. Было показано, что, помимо влияния на цитотоксическую активность гемоцитов, лектины растительного и животного происхождения способны изменять кислородный метаболизм клеток (Hahn et al., 2000). Продукция активных форм кислорода достигала максимума при использовании в качестве стимулятора конъюгата БСА-Gal, что указывает на важную роль в реакциях распознавания молекул галактозы в терминальном положении. Еще одним примером подобных взаимодействий может служить участие лектинов, играющих роль опсонинов при взаимодействии с чужеродными субстратами при фагоцитозе у различных представителей двустворчатых моллюсков (Tripp, 1992). Кроме того, использование лектинов, специфичных к NAcGlc и NAcGal, в качестве индукторов пролиферации приводило к достоверному увеличению уровня включения BrdU в гемоциты M. edulis (Pipe et al., 1997).
При постановке «обратного» эксперимента, т.е. при обработке гемоцитов лектинами, достоверное увеличение гемолитической активности клеток было зарегистрировано при использовании лектинов картофеля и сои, когда уровень гемолиза достиг 0.,214±0.,024 и 0.,242±0.,022 ед.ОП, соответственно. Полученные результаты однозначно указывают на то, что данные лектины способны непосредственно взаимодействовать с поверхность гемоцитов, вызывая активацию клеток. Использование остальных лектинов не приводило к изменению гемолитической активности клеток. Можно предполагать, что некоторые лектины способны экранировать определенные рецепторы на клетках мидии, тем самым, снижая эффективность распознавания клеток-мишеней, что приводит к снижению уровня лизиса эритроцитов. Этот факт подтверждают данные литературы, указывающие на то, что лектины с различной углеводной специфичностью способны к избирательному связыванию с клетками моллюсков Mytilus edulis, Cerastoderma edule и Ensis siliqua (Wootton et al., 2003). Так, КонА взаимодействует с большинством циркулирующих клеток моллюсков вышеперечисленных видов моллюсков, тогда как лектины завязей пшеницы и арахиса связываются менее чем с половиной гемоцитов. Результаты эксперимента с десиализированными эритроцитами показали, что удаление гликокаликса с поверхности клеток приводит к снижению уровня гемолитической активности, что еще раз указывает на углеводную природу распознаваемых гемоцитами молекул. Вместе с тем, использование лектина сои приводило почти к 3-кратному увеличению цитолитической активности гемоцитов.
При исследовании углеводной специфичности гуморальных факторов гемолимфы мидии было показано, что титр гемагглютининов достоверно возрастал лишь в случае обработки эритроцитов лектинами, специфичными к aDMan (конА и лектин гороха). Незначительные, в среднем на одно двукратное разведение гемолимфы, увеличения титра гемолизинов были отмечены в случае обработки эритроцитов лектинами завязей пшеницы и арахиса, также специфичными к NAcGlc и NAcGal, соответственно.
Таким образом, в ходе серии экспериментов было показано, что опсонизация эритроцитов млекопитающих лектинами, специфичными к NAcGlc (лектины картофеля и завязей пшеницы) или NAcGal (лектины сои, бузины черной, арахиса и улитки), приводила к усилению гемолитической активности гемоцитов M. edulis. Среди гуморальных факторов гемолимфы было зарегистрировано достоверное увеличение титров гемагглютининов при обработке эритроцитов лектинами, специфичными к маннозе. Таким образом, клеточные механизмы врожденного иммунитета играют ключевые роль в распознавании патогена, а наличие углеводных детерминант, специфичных к NAcGlc и NAcGal, значительно повышает эффективность этих реакций. Гуморальные факторы, по-видимому, выполняют вспомогательные функции.
Работа поддержана грантами РФФИ № 07-04-00095, 07-04-01675 и ИНТАС № 05-1000008-8056. Литература
Boswell C.A., Bayne C.J., 1986. Lectin-dependent cell-mediated cytotoxicity in an invertebrate model: Con A
does not act as a bridge // Immunology. V.57. P. 261-264.
Carballal M.J., Lopez C., Azevedo C., Villalba A., 1997. Enzymes involved in defense functions of hemocytes of mussel Mytilus galloprovincialis // J. Invert. Path. V. 70. P. 96-105.
Castillo M.G., Yoshino T.P., 2002. Carbohydrate inhibition of Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cell
adhesion to primary sporocysts of Schistosoma mansoni // Parasitology. V. 125 (Pt 6). P. 513-525.
Fryer S.E., Bayne C.J., 1996. Phagocytosis of latex beads by Biomphalaria glabrata hemocytes is modulated in a strain-specific manner by adsorbed plasma components // Dev. Comp. Immunol. V. 20. P. 23-37.
Hahn U.K., Bender R.C., Bayne C.J., 2000. Production of reactive oxygen species by hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specifc stimulation // Dev. Comp. Immunol. V. 24. P. 531-541.
Johnston L.A., Yoshino T.P., 1996. Analysis of lectin- and snail plasma-binding glycopeptides associated with the tegumental surface of the primary sporocysts of Schistosoma mansoni // Parasitology. V. 112. P. 469-479.
Pipe R.K., Farley S.R., Coles J.A., 1997. The separation and characterisation of haemocytes from the mussel Mytilus edulis // Cell Tissue Res. V. 289. P. 537-545.
Tripp M.R., 1992. Agglutinins in the hemolymph of the hard clam, Mercenaria mercenaria // J. Invert. Path. V. 59. P. 228-234.
Wootton E.C., Dyrynda E.A., Ratcliffe N.A., 2003. Bivalve immunity: comparisons between the marine mussel (Mytilus edulis), the edible cockle (Cerastoderma edule) and the razor-shell (Ensis siliqua) // Fish Shellfish Immunology. V. 15. P. 195-210.