ВЛИЯНИЕ АККУМУЛЯЦИИ РТУТИ НА АКТИВНОСТЬ СА2+-АКТИВИРУЕМЫХ ПРОТЕИНАЗ В ТКАНЯХ ОКУНЕЙ (PERCA FLUVIATILIS) ИЗ ОЗЕР ВБЛИЗИ БИОСТАНЦИИ КАРТЕШ (БЕЛОЕ МОРЕ)

Е.И. Кяйвяряйнен¹, Е.В. Борвинская¹, Н.Н. Немова¹, В.Т. Комов²

¹Учреждение Российской академии наук Институт биологии Карельского научного центра РАН, г.

e-mail: hela_kaiv@mail.ru

В последнее время в связи с возрастающим антропогенным воздействием на окружающую среду значительно возросло внимание к проблеме существования и выживания организмов под воздействием неблагоприятных факторов окружающей среды. Среди неблагоприятных воздействий можно выделить увеличение концентрации токсических агентов, в особенности тяжелых металлов. Попадая в организм они оказывают негативное влияние на все уровни организации, включая субклеточный. Действие на ор­ганизм токсических и экологических факторов внешней среды сопровождается вовлечением клеточных и молекулярных механизмов регуляции гомеостаза. Среди множества механизмов регуляции внутри­клеточного метаболизма важное место занимает протеолиз, т.к. протеолитические ферменты действуют на первом, ключевом этапе метаболизма белковых резервов клетки (Немова, 1996).

Особое место среди тяжелых металлов занимает ртуть, обладающая уникальными экогеохи­мическими и экотоксикологическими свойствами, обусловленными ее вездесущностью, разнообра­зием форм существования, повышенной возможностью распределения и биопереноса в окружаю­щей среде, а также широким и разносторонним спектром негативных воздействий на организмы и их популяции (Немова, 2005).

Известно, что ртуть накапливается в водоемах, и в условиях закисления, органической и микроб­ной загрязненности, повышенной цветности воды, связывается с фульвокислотами, образуя опасные ртутьорганические комплексы метилртути (Комов, 1999). Основным путем поступления ртути в орга­низм является её потребление с пищей.

Метиловые формы ртути являются более жирорастворимыми по сравнению с неорганической формой. Это обеспечивает проникновение MeHg через клеточные мембраны и поражение органов и тканей организма, что ведет к изменению белкового и липидного обмена (Голованова, Комов, 2005). В клетке преимущественным местом аккумуляции ртути является цитозоль, умеренные коли­чества ртути обнаружены в ядерной, митохондриальной и микросомальной фракциях, а в лизосо­мах не выявлено сколько-нибудь значимое ее накопление (Bose et al., 1993). Ртуть неблагоприятно влияет на целый ряд клеточных функций, включая регулирующие уровень свободного Са²⁺ в цито­золе. Увеличение содержания кальция за счет его высвобождения из внутриклеточных депо проис­ходит сопряженно с накоплением ртути в цитозоле. (Nathanson et al., 1995).

Инструментом клеточно-молекулярных приспособлений служат ферменты, главными функ­циями которых в клетке являются катализ биохимических реакций и регуляция обмена веществ. Ключевую роль в поддержании метаболического гомеостаза играет протеолитическая ферментная система. Именно с этим связан отрицательный эффект, оказываемый токсикантами на молекуляр­ном уровне. Он заключается в индукции или ингибировании ферментов и ферментных систем и связанных с ними функций.

Кальций-активируемые протеиназы цитозоля (кальпаины) относятся к группе цистеиновых (тиоловых) протеиназ и показывают большую чувствительность к воздействию ртути, поэтому мо­гут служить в качестве биоиндикаторов ртутного воздействия на организм (Немова, 2005).

представляют собой биолиганды для связывания ртути, т.к. содержат структурные и функ­циональные SH-группы;

локализованы в цитозоле, преимущественном месте депонирования ртути в клетке; проявляют активность, абсолютно зависимую от наличия Са²⁺, концентрация которого меня­

ется от ртутной нагрузки;

в процессе блокирования ионами ртути тиоловые группы цистеин-зависимых протеиназ теря­ют свои реакционные свойства, что, в свою очередь, угнетает целый ряд метаболических путей, та­ких как каскадные процессы образования комплемента, фибринолизиса и др. (Антонов, 1983). Ин­гибирование цистеинзависимых ферментов снижает скорость белкового обмена и реакций, регули­руемых этими ферментами.

Два вида Са²⁺-зависимых нейтральных протеиназ, активируемых микромолярными (40-100 мкМ) и миллимолярными (1-5 мМ) концентрациями Са²⁺, - кальпаин I и кальпаин II, могут присут­ствовать в ткани одновременно, хотя их соотношение может быть различным (Suzuki et al., 1988). Присоединение Са²⁺ приводит к диссоциации молекулы фермента на субъединицы: большую ката­литическую 80 кДа и малую регуляторную 30 кДа. Субъединица 80 кДа полностью ферментативно активна.

Объектом исследований был выбран речной окунь Perca fluviatilis L. Взрослый окунь являет­ся хищником, и в малых озерах Карелии часто занимает положение на вершине водной трофиче­ской цепи, накапливая большие концентрации ртути, что может угрожать здоровью человека при потреблении этой рыбы в пищу. Окунь был выловлен из озер Карелии Среднее, Жемчужное, Круг­лое и Кривое, расположенных вблизи ББС «Картеш» (Белое море). Содержание ртути в биологиче­ском материале определяли с помощью метода атомной абсорбции (Назаренко и др. 1986) в Инсти­туте БВВ РАН. По имеющимся данным накопление ртути в мышцах максимально у окуней из озера Жемчужное и превышает ПДК, минимально для окуней из озера Кривое.

Пробы мышц окуней (самки) из озера Круглое выделены в 2 группы с минимальным (min) и максимальным (max) содержанием ртути.

Таблица 1

Среднее содержание ртути в мышцах окуней из исследованных озер

Данные, характеризующие такие свойства озер как кислотность и содержание органического углерода получены для озер Кривое и Круглое (таб. 2).

Таблица 2.

Характеристика озер Круглое и Кривое

Рис. 1. Профиль распределение водорастворимых белков (----- ) Са²⁺-активируемой активности (—) в мышцах

самок окуня (Perca fluviatilis) из оз. Среднее. Т₂₈₀ - поглощение белка, МЕ - международные единицы актив­ности фермента

Профили элюции водорастворимых белков в различных тканях окуня после гель-хроматографии на Sephacryl SH-300 соответствуют распределению белков по молекулярным массам (рис.1).

колонки белки делятся на три пика: первыми с колонки выходят высокомолекулярные белки (Mr 400-110 кДа), затем белки с Mr в пределах 110-60 кДа, последними - низкомолекулярные вещества белковой при­роды, пептиды. Протеолитическая активность, инициируемая ионами кальция, согласно методу (Yoshimura

N. et al., 1983), обнаруживается в трех фракциях белкового элюента и определяется как сумма трех пиков активностей (рис.1) в МЕ единицах, соответствующих Е280/г ткани за 30 мин реакции при 30⁰ С.

Активность кальций-активируемых протеиназ исследовалась в образцах мышечной ткани как в месте максимального накопления ртути (Немова и др., 2001). В экспериментах сравнивали уро - вень активности кальпаинов в группах рыб аналогичного пола и возраста, так как показана зависи­мость активности протеиназ от этих показателей (Немова, 2005).

Полученные в ходе эксперимента результаты по определению уровня активности кальций-за- висимых протеиназ (KI, KII и субъединицы) в мышцах окуней, выловленных из всех исследуемых озер, представлены на рис. 2, а также для окуней (самки) из озера Кривое получены данные для раз­личных тканей (жабры, мышцы, печень и гонады) (рис. 3).

Рис. 2. Уровень Са²⁺- зависимой активности в мышцах окуней (Perca fluviatilis) с различным содержанием ртути

Рис. 3. Уровень Са²⁺- зависимой активности в гонадах, жабрах, печени и мышцах окуня (Perca fluviatilis) в расчете на г ткани из озера Кривое

Как следует из экспериментальных данных (рис. 2) по мышцам окуней из различных озер, Са²⁺-зависимая суммарная активность (кальпаинов I, II и субъединиц) в мышцах окуней из озера Жемчужное, с максимальным содержанием ртути в мышцах, ниже, чем в других образцах. При воз­растании концентрации ртути в мышечной ткани окуней (самки) из озера Круглое активность цис- теин-зависимых протеолитических ферментов уменьшается.

Что касается субъединичной активности, то она максимальна в мышцах самок окуней из озе­ра Среднее, и минимальна в мышцах самок из озера Круглое. Оба озера характеризуются средним содержанием ртути. Для всех проб характерно доминирование субъединичной активности, за ис­ключением озера Круглое, где преобладает активность кальпаина I. Активность субъединицы сви­детельствует о неустойчивости фермента в данных условиях.

Второе место по уровню активности, в основном, занимает кальпаин I, хотя его активность меньше там, где преобладает субъединичная активность. Активация кальпаина II косвенно указыва­ет на развитие приспособительных реакций Са²⁺-зависимого протеолиза в клетке и на развитие па­тологического процесса. Соотношение активности кальпаина I и кальпаина II при изменении содер­жания ртути в мышцах меняется.

Сравнивая уровень активности кальпаинов в мышцах у самок и самцов окуней из озер Жем­чужное и Среднее, выявили, что суммарная активность фермента выше у самок по сравнению с самцами при почти одинаковом содержании ртути в мышцах. Таким образом, обнаружены разли­чия в активности ферментов Са²⁺-активируемого протеолиза в зависимости от пола. Это хорошо видно в озере Среднее, особенно по уровню субъединичной активности. У самок активность каль- паинов выше, что, возможно, связано с большей активностью адаптативных реакций. Это указывает на наличие половых различий в механизмах адаптации, запускаемых в ответ на действие неблаго­приятных факторов.

Суммарная активность Са²⁺-активируемых протеиназ в жабрах исследуемых рыб из озера Кривое выше во много раз по сравнению с другими органами (рис. 3). Это связано с тем, что жабры выполняют барьерную функцию и в первую очередь поражаются присутствующими в воде повреж­дающими агентами. Это вызывает активацию субклеточных адаптативных механизмов, в особенно­сти ферментов протеолиза, в том числе цистеинзависимых протеиназ цитозоля. Существенно мень­шую активность Са⁺²-зависимые протеиназы проявляют в мышцах. Сходный уровень активности в ходе опыта выявлен в тканях печени, для которой характерна фильтрация вредных веществ из кро­ви и связанные с этим активные процессы детоксикации. Минимальная активность кальпаинов оп­ределена в гонадах, которая зависит от стадии зрелости (Немова, 1996). Таким образом, показана тканеспецифичность уровня активности Са²⁺-активируемых протеиназ у исследуемых окуней. Мак­симальная активность фермента обнаружена в жабрах, затем в мышцах, печени и гонадах.

Обнаружено влияние аккумуляции ртути в мышцах окуней на активность кальпаинов. Цисте- ин-зависимые ферменты являются мишенью для токсического действия ртути, ионы которой взаи­модействуют с тиоловыми группами их активных центров, тем самым лишая их каталитической ак­тивности. Даже незначительные концентрации обладают ингибирующим действием на метаболизм клетки и, соответственно, на активность Са²⁺-зависимой протеолитической системы. Повреждаю­щее действие соединений ртути на молекулярном уровне проявляется в ингибировании ферментов, необратимых конформационных изменениях белковых макромолекул и, как следствие, изменение скорости процессов метаболизма.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Президента РФ «Ведущие научные школы России» НШ-306.2008.4; гранта РФФИ 08-04-01140, программы ОБН РАН «Биологические ресурсы России».

Литература

Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Мир, 1983. 367 с.

Голованова И.Л., Комов В.Т. Пищеварительные карбогидразы плотвы при различном накоплении рту­

ти в организме. Тез.докл.ІУ Междун.конф. «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Се­вера» Вологда. 2005. Ч.І. С. 103-105.

Комов В.Т. Природное и антропогенное закисление малых озер Северо-Запада Росси: Причин, послед­ствия, прогноз: Автореф. дис. ... докт.биол.наук. СПб., 1999. 45 с.

Назаренко И.И., Кислоева И.В., Кашина Л.И и др. Атомно-адсорбционное определение ртути в водах после сорбционного концентрирования на полимерном тиоэфире // Журн.аналит.химии. 1986. Т. 11, № 8. С. 1385-1390.

Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты у рыб. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 1996.

216 с.

Немова Н.Н. Биохимические эффекты накопления ртути у рыб. М: Наука, 2005. 161 с.

Немова Н.Н., Кяйвяряйнен Е.И., Крупнова М.Ю., Бондарева Л.А. Активность внутриклеточных проте­олитических ферментов в тканях окуня Perca fluviatilis с различным содержанием ртути // Вопр.ихтиол. 2001. Т. 41. № 5. С.704-707.

Bose S., Ghosh P., Bhattacharya S. Distribution kinetics of inorganic mercury in the subcellular fractions of fish liver // Sci.Total Environ. 1993. Supplement, pt.1. P.533-538.

Nathanson M.H., Mariwalla K., Ballatori N., Boyer J.L. Effects of Hg²⁺ on cytosolic Ca²⁺ in isolated skate hepatocytes //Cell.Calcium. 1995. Vol.18, N5. P.429-439.

Suzuki K., Imajoh S., Emori Y. et al. Regulation of activity of calpain // Adv/Enzymol.Regulat/ 1988. Vol. 27. P. 153-162.

Yoshimura N., Kikuchi T., Sasaki T., Kitahara A., Hatanaka M., Murachi T. Two distinct Ca-proteases (calpain I and calpai II) purified concurrently by the same method from rat kidney. J.Biol.Chem. 1983. Vol.258. P. 8883-8889.

EFFECT OF ACCUMULATION OF MERCURY ON ACTIVITY CA2+-ACTIVATED PRO- teinases in tissues of perches (perca Fluviatilis l.) from lakes near BIOLOGICAL RESEARCH STATION KARTESH (WHITE SEA).

¹Kaivarainen E., ¹Borvinskaya E., ¹Nemova N., ²Komov V.

¹Institute of Biology KRC RAS Petrozavodske E-mail: hela_kaiv@mail.ru ²Institute of Internal Water Biology RAS

'Influence of accumulation of mercury in muscles of perches from lakes near White sea on activityof cystein Ca-dependent proteinases is revealed. It is connected with inhibition of cystein enzymes as a result of interaction mercury with tiolic groups of their active centers.