РОЛЬ NF-KB И MAPK В АКТИВАЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ARC3-LIKE В ГЕПАТОПАНКРЕАСЕ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ ASTERIAS RUBENS ПРИ ДЕЙСТВИИ БАКТЕРИАЛЬНОГО ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

Д.А. Могиленко ^1,2, Д.А. Сафина ¹, И.В. Кудрявцев ^{1,2 1} ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, г. Санкт-Петербург, Россия ² Санкт- Петербургский государственный университет, г .

Компонент комплемента C3 играет важную роль в защитных реакциях и в реализации разно­образных механизмов врожденного и приобретенного иммунитета у животных. Одной из наиболее существенных функций C3 является участие в активации системы комплемента (Walport, 2001). В последнее время появляются данные об участии C3 в различных процессах приобретенного имму­нитета, таких как процессинг антигена (Villiers et al., 2008), регуляции дифференцировки и созрева­ния дендритных клеток (Reis et al., 2008), а также развитии B-клеток памяти и регуляторных T-лим­фоцитов (Ghannam et al., 2008). У позвоночных синтез и экспрессия С3 происходит главным обра­зом в печени (Alper et al., 1969), однако в очаге воспаления эту способность приобретают и макро­фаги (Colten et al., 1986). У беспозвоночных животных экспрессия С3 найдена в циркулирующих клетках: гемоцитах у асцидий (Nonaka et al., 1999) и целомоцитах у морских ежей (Al-Sharif et al., 1998). Было показано, что у беспозвоночных вторичноротых C3 действует как опсонин, усиливая способность макрофагоподобных клеток к фагоцитозу бактериального патогена (Clow et al., 2004). Интересно, что у морского ежа уровень экспрессии гена, кодирующего гомолог C3, возрастает в от­вет на действие бактериального липополисахарида (Clow et al., 2000). Несмотря на это, сигнальные пути, регулирующие экспрессию гена C3 при действии ЛПС, все еще плохо изучены, как у позво­ночных, так и у беспозвоночных животных.

В ходе предварительных исследований у морской звезды Asterias rubens фрагмент гена, гомо­логичного компоненту комплемента С3. Филогенетический анализ этого гена, названного ArC3- like, показал его близкое родство с генами гомологов C3 вторичноротых беспозвоночных живот­ных.

Целью этой работы являлось изучение NF-κΒ и MAPK сигнальных путей в процессе актива­ции экспрессии гена ArC3-like в гепатопанкреасе морской звезды Asterias rubens в ответ на дейст­вие бактериального ЛПС.

Материалы и методы

Сбор экспериментальных животных Asterias rubens (Echinodermata: класс Asteroidea, отряд Forcipulata) производили в июне-августе 2008 г. на базе Беломорской Биологической Станции им. акад. О.А.Скарлато ЗИН РАН. Для экспериментов использовали морских звезд с длинной луча 10±2 см. Печеночные выросты (гепатопанкреас) получали сразу после диссекции морской звезды и перфу- зировали стерильной морской водой (СМВ). Далее гепатопанкреас инкубировали 48 ч в полной куль­туральной среде на основе среды RPMI-1640 с добавлением NaCl (до 24 %о), 10 % стерильной пулиро- ванной сыворотки интактных морских звезд A.rubens, 10 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина и 80 мкг/мл гентамицина. После чего трижды отмывали СМВ и переводили в свежую среду RPMI-1640.

Ингибиторы сигнальных киназ

Ингибиторы MAP киназ были получены из Biomol: SB203580 (ингибитор p38 MAP); JNKinh II (ингибитор JNK1/2/3); U0126 (ингибитор MEK1/2). Ингибитор активации NF-κΒ (QNZ) был получен из Tebu-bio. Раствор ЛПС из Salmonella typhimurium приготовляли ex tempera раствор ЛПС на СМВ. Инги­биторы добавляли за 1 ч до добавления ЛПС (50 мкг/мл), после чего гепатопанкреас инкубировали 24 ч.

Выделение тотальной РНК и реакция обратной транскрипции

Тотальную РНК из гепатопанкреаса морской звезды выделяли, используя реагент STAT-60 («TEL-TEST») в соответствии с инструкциями изготовителя.

Ретро-ПЦР-анализ (RT-PCR) и количественный ретро-ПЦР-анализ (qRT-PCR)

Праймеры для ПЦР подбирали с использованием программы «Primer», разработанной В. Прутковским и O. Сокур (Институт Гриппа, РАМН). В работе были использованы праймеры, по­добранные нами к кДНК гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH) морской звезды (5'-ATTGCTGAGGGGTTGATGAC-3' и 5'-CTGGAACACGAAAAGCCATT-3') и праймеры кДНК гена морской звезды ArC3-like (5'-TTCCTTGGCTCTCAACGTCT-3' и 5'- TGCAAAAACAGCAAATGAGC-3'). qRT-PCR проводили при помощи анализатора нуклеиновых кислот АНК-32 (Институт Аналитического Приборостоения РАН), используя технологию SyberGreen по следующей схеме: 3 мин 95°C, затем 45 циклов, включающих 30 с 95°C, 20 с 60°С и 30 с 72°С. Рассчитанные количества кДНК каждого из генов нормировали по уровню экспрессии ге­на «домашнего хозяйства», (GAPDH), и представляли как относительный уровень экспрессии гена, принимая за 100% уровень экспрессии в контрольных клетках.

Результаты исследования

Бактериальный ЛПС увеличивает уровень мРНК ArC3-like в гепатопанкреасе морской звезды

in vivo.

Введение раствора ЛПС в целомическую полость морской звезды (с концентрацией в целоми­ческой жидкости 50-100 мкг/мл) приводило к увеличению уровня экспрессии гена ArC3-like в пече­ночных выростах, через 24 ч. Введение СМВ не влияло на уровень экспрессии гена ArC3-like в пе­ченочных выростах. Изучение временной динамики экспрессии гена ArC3-like в печеночных вы­ростах при действии ЛПС показало увеличение уровня экспрессии этого гена через 6 ч, которое достигало максимума через 12-24 ч после воздействия ЛПС в печеночных выростах .

Ингибирование сигнальных путей NF-kB и MEK1/2 приводит к отмене ЛПС-зависимой акти­вации экспрессии гена ArC3-like в гепатопанкреасе морской звезды in vitro.

Для определения сигнальных путей, вовлеченных в ЛПС-зависимое усиление экспрессии гена ArC3-like в печеночных выростах морской звезды, мы использовали химические ингибиторы NF- κΒ, JNK, p38 MAP и MEK1/2. Добавление ЛПС к печеночным выростам морской звезды in vitro приводило к увеличению уровня мРНК ArC3-like в 2,37±0,06 раза по сравнению с контрольным до­бавлением СМВ (рис. 1). Добавление ингибитора NF-κΒ приводит к активации уровня экспрессии гена ArC3-like примерно в 3,5 раза и отменяет эффект ЛПС-зависимой активации экспрессии гена ArC3-like. Ингибирование JNK, p38 MAP и MEK1/2 приводит к уменьшению экспрессии гена ArC3-like на 94,2±0,3%, 90,2±0,6% и 83,0±4,5%, соответственно (рис. 1). Однако к отмене ЛПС-за- висимой активации экспрессии гена ArC3-like приводило только ингибирование MEK1/2, в то вре­мя как добавление ингибитора JNK приводило только к частичной отмене усиления экспрессии ге­на ArC3-like при действии ЛПС. Добавление ингибитора p38 MAP не уменьшало степень активации экспрессии гена ArC3-like при действии ЛПС (рис.).

Роль NF-kB, JNK, p38 MAP и MEK1/2 в ЛПС-зависимой активации экспрессии гена ArC3-like в гепатопан- креасе морской звезды in vitro. NF-kB inh - QNZ (40nM, ингибитор активации NF-kB), p38 inh - SB203580 (50 мкМ, ингибитор p38 MAP); JNK inh - JNKinh II (20 мкМ, ингибитор JNK1/2/3); MEK1/2 inh - U0126 (20мкМ, ингибитор MEK1/2).

ошибка среднего Обсуждение результатов

В этой работе мы показали ЛПС- зависимую активацию экспрессии гена , гомологичного С 3 (ArC3-like), в печеночных выростах у морской звезды Asterias rubens. В печеночных выростах уро­вень экспрессии гена ArC3-like возрастает уже через 6 ч и остаетя повышенным по сравнению с ба­зальным уровнем даже через 24-48 ч с момента введения бактериального ЛПС. Известно, что ЛПС

действует на TLR позвоночных и беспозвоночных животных, приводя к NF-kB и MAPK-зависимой активации экспрессии генов провоспалительных факторов и генов острой фазы иммунного ответа. Известно, что в геноме морского ежа S.purpuratus, филогенетически близкородственного морской звезде, содержится 222 гена, потенциально кодирующих толл-подобные белки (TLR), в результате экспрессии которых может образоваться как минимум 350 белковых продуктов, что, по мнению ав­торов, может свидетельствовать о наличии у иглокожих неких механизмов, позволяющих увели­чить спектр распознаваемых патогенов (Pancer, Cooper, 2006). Однако механизмы диверсификации этой группы Toll-подобных белков пока не изучены. Подобного рода способы увеличения спектра распознаваемых лигандов описаны и для других групп беспозвоночных и позвоночных животных, причем в качестве распознаваемых молекул используются как белки, обогащенные лейцин-богаты­ми повторами, так и белки, несущие иммуноглобулиновые молекулы (Pancer, Cooper, 2006). Кроме того, в геноме иглокожих присутствуют гомологи генов транскрипционных факторов сигнального пути NF-kB (Hibino et al., 2006). Ингибирование NF-kB отменяет эффект ЛПС-зависимой активации экспрессии гена ArC3-like у морской звезды (рис. 1), что, по-видимому, указывает на участие NF- кВ в передаче активаторного сигнала от ЛПС на экспрессию гена ArC3-like в клетках печеночных выростов.

Литература

Alper C.A., Johnson A.M., Birtch A.G., Moore F.D., 1969. Human C3: evidence for the liver as the primary site of synthesis // Science. V. 163. P. 286-288.

Al-Sharif W.Z., Sunyer J.O., Lambris J.D., Smith L.C., 1998. Sea urchin coelomocytes specifically express a

homologue of the complement component C3 // J. Immunol. V. 160. P. 2983-2997.

Clow L.A., Gross P.S., Shih C., Smith L.C., 2000. Expression of SpC3, the sea urchin complement component, in response to lipopolysaccharide // Immunogenetics. V. 51. P. 1021-1033.

Clow L.A., Raftos D.A., Gross P.S., Smith L.C., 2004 The sea urchin complement homologue, SpC3, functions as an opsonin // J. Exp. Biol. V. 207 (12). P. 2147-2155.

Colten H.R., Strunk R.C., Perlmutter D., Cole F.S., 1986. Regulation of complement protein biosynthesis in mononuclear phagocytes // Ciba Found Symp. V. 118. P. 141-154.

Ghannam A., Pernollet M., Fauquert J.L., Monnier N., Ponard D., Villiers M.B., Peguet-Navarro J., Tridon A., Lunardi J., Gerlier D., Drouet C., 2008. Human C3 deficiency associated with impairments in dendritic cell differentiation, memory B cells, and regulatory T cells // J. Immunol. V. 181 (7). P. 5158-5166.

Hibino T., Loza-Coll M., Messier C., Majeske A.J., Cohen A.H., Terwilliger D.P., Buckley K.M., Brockton V., Nair S.V., Berney K., Fugmann S.D., Anderson M.K., Pancer Z., Cameron R.A., Smith L.C., Rast J.P., 2006. The immune gene repertoire encoded in the purple sea urchin genome // Dev. Biol. V. 300. P. 349-365.

Nonaka M., Azumi K., Ji X., Namikawa-Yamada C., Sasaki M., Saiga H., Dodds A.W., Sekine H., Homma M.K., Matsushita M., Endo Y., Fujita T., 1999. Opsonic complement component C3 in the solitary ascidian, Halocynthia roretzi // J. Immunol. V. 162. P. 387-391.

Pancer Z., Cooper M.D., 2006. The evolution of adaptive immunity // Annu. Rev. Immunol. V. 24. P. 497-518.

Reis E.S., Barbuto J.A., Kohl J., Isaac L., 2008. Impaired dendritic cell differentiation and maturation in the absence of C3 // Mol. Immunol. V. 45 (7). P. 1952-1962.

Villiers C.L., Cretin F., Lefebvre N., Marche P.N., Villiers M.B., 2008. A new role for complement C3: regulation of antigen processing through an inhibitory activity // Mol. Immunol. V. 45 (13). P. 3509-3516.

Walport M.J., 2001. Advances in immunology: complement (first of two part) // N. Engl. J. Med. V. 344. P. 1058-1066.