ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ БЕЛОМОРСКОЙ ТРЕСКИ НА БОЛЕВУЮ СТИМУЛЯЦИЮ
Л.С. Червова
Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, каф. ихтиологии, г. Москва, Россия
e-mail: lily_chervova@mail.ru Введение
На современном этапе изучение биологических основ гуманного отношения к рыбам как объектам лова, хозяйственного использования и научного экспериментирования является наиболее динамично развивающимся направлением в биологии рыб и включает эволюционные, экологические, поведенческие, этические, биохимические и физиологические аспекты (VIIth Congress on biology of fish, 2006).
Значительно возросло число работ, направленных на изучение рецепции болевых стимулов, структуры ноцицептивных рецепторов, а также фармакологических средств обезболивания у рыб (Червова, Лапшин, 2000; Sneddon, 2003; Newby et al., 2008).Изучение болевых реакций у рыб, как и у других безголосых немлекопитающих, очень затруднено из-за сложности выработки методических приёмов, позволяющих дозировать стимул и измерять величину ответа на него.
Целью нашей работы было изучение способности морских рыб отвечать на болевые стимулы, а также возможности модуляции болевой чувствительности опиоидными и неопиоидными анальгетиками у беломорской трески.
Материал и методика
Опыты проводили на Беломорской биологической станции МГУ, залив Великая Салма. Объектом исследований служила беломорская треска Gadus morhua maris albi массой 100300г. Всего использовано около 200 особей. Выловленных рыб держали в садках в течение 10 дней, затем переносили в лабораторный аквариум и через три дня брали в опыт.
Для изучения ответов рыб на болевые стимулы была разработана оригинальная методика, базирующаяся на регистрации моторно- двигательной реакции, направленной на устранение болевого стимула.
Рыбу фиксировали в станке (в области рта и грудных плавников), при этом хвостовой стебель оставался незакреплённым. Жабры постоянно орошались проточной водой.
Подвижная плексигласовая «вилка» охватывала хвостовой стебель в задней трети тела. Каждое движение хвостового стебля, которое отклоняло «вилку» от нулевой точки, регистрировалось специально сконструированным электронным интегратором с цифровой индикацией. Амплитуда и длительность этих движений, отражающих импульс силы (ньютон-с), характеризовали величину усилия, развиваемого хвостовым стеблем рыбы в ответ на болевую стимуляцию. В качестве болевого стимула использовали точечные уколы кожи иглой, сильное сдавливание плавников ножницами или пинцетом, не приводящее к разрыву тканей, а также электрическое раздражение хвостового плавника (залп длительностью 0,1 с, состоящий из 30 импульсов по 0,5 мс каждый). Раздражающие электроды вводили в эпителиальную ткань лопасти хвостового плавника, что исключало непосредственное раздражение мышечных волокон. Амплитуду стимула подбирали в каждом опыте индивидуально (4-7в). Регистрирующая система запускалась одновременно с подачей болевого раздражителя. В качестве анальгетиков использовали: μ-опиоидные пептиды β-казоморфин и дерморфин, психотропный препарат сиднофен, анальгин и новокаин. Эти вещества предъявляли различными способами: интраназально (β-казо- морфин и дерморфин) по 20 мкл в оба обонятельных мешка одновременно, внутрибрюшинно (сиднофен, β-казоморфин, анальгин), внутримышечно (анальгин), подкожно (новокаин). Треске вводили растворы β-казоморфина интраназально (2,5, 5, 7,5, 10, 12,5 мг/кг) и внутрибрюшинно (10, 15, 20, 25, 30 мг/кг), дерморфина интраназально 0,02-020 мг/кг), растворы сидно- фена (15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100 мг/кг) внутрибрюшинно, 50% раствор анальгина (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 мл) внутрибрюшинно и внутримышечно (0,25, 0,5, 0,75, 1мл), 2% раствор новокаина подкожно и в ткань плавника (0,1, 0,25, 0,5, 0,75 мл). Контрольным животным вводили такие же объёмы физраствора.Ноцицептивную чувствительность рыб измеряли с интервалом 5мин в течение одного часа до (норма) и одного двух часов после введения анальгетика.
Величину анальгезии (снижение болевой чувствительности) рассчитывали в процентах по отношению к норме. Полученные данные статистически обрабатывали по Манну-Вилкоксону-Уитни.Результаты
Наиболее чувствительными ноцицептивными зонами были хвостовой и спинные плавники, грудные плавники, кожа вокруг глаз, эпителий обонятельного мешка; менее чувствительными - кожа поверхности головы и тела. Двигательные ответы на ноцицептивную стимуляцию хвостового плавника путем кратковременного (1 с) механического сжатия или электрического раздражения были наиболее сильными и стабильными. В дальнейшем для исследований эффектов анальгетических веществ мы наносили болевой стимул только на лопасть хвостового плавника. В момент нанесения ноцицептивного стимула частота дыхательных движений достигала 4-5/с.
Инъекция в эпителиальную ткань плавников или подкожно в месте нанесения стимула 0,25 мл 2% раствора новокаина (локально блокирующего нервное проведение) полностью устраняло ноцицептивные ответы.
Анальгетический эффект опиоидного анальгетика β-казоморфина (снижение реакций на механические болевые стимулы) наблюдался через 10-15 мин после введения на 15-37% (интраназально) (рис. 1а) и на 14-35% (внутрибрюшинно) (рис. 1б). Одна и та же концентрация β-казоморфина при интраназальном введении вызывала больший анальгетический эффект, чем при внутрибрюшинном. Дерморфин (интраназально) снижал болевую чувствительность на 55% в концентрации 0,20 мг/кг в июле и 0,02 мг/кг в сентябре. Сиднофен, водимый внутрибрюшинно, вызывал снижение ответов на механические болевые стимулы на 15-89% в зависимости от концентрации (рис. 2). Однако следует отметить, что этот препарат в концентрациях 40 мг/кг и более вызывал гибель рыб через 1-3 часа после окончания опыта и переноса рыб в лабораторный аквариум. У рыб, которым вводили меньшие концентрации сиднофена, по окончании опыта поведение было обычным.
Анальгин, вводимый треске в виде 50% раствора внутрибрюшинно, оказывал очень слабое действие на ноцицептивные ответы рыб.
Реакции на механические болевые стимулы снижались на 16-21%, хотя применяемые концентрации были высокими (после введения 2 мл/100г наблюдалась гибель рыб в лабораторном аквариуме через несколько часов после окончания опыта). Этот же препарат, вводимый внутримышечно вблизи хвостового плавника, оказывал значительный анальгетический эффект (29-45%), хотя применялся в более низких концентрациях.
Отмечено также, что порог болевой чувствительности значительно повышается у беломорской трески в результате стресса, связанного с выловом и переносом рыб в лабораторный аквариум
в течение 2-3 суток после вылова наблюдалось почти полное угнетение двигательных ответов на механические болевые стимулы.
Обсуждение результатов
Наши данные показывают, что у морских рыб, как и у других позвоночных, в ответ на ноцицептивный стимул первой проявляется поведенческая защитная реакция - движение, направленное на устранение болевых ощущений. У наземных животных это может быть отдёргивание конечности, отведение хвоста, побег, прыжок и т.д. У рыб - попытка уплыть, которая начинается с движения хвостового стебля. Ноцицептивных ответ в большинстве случаев регистрируется как изолированный поведенческий акт, но это только один компонент.
Интегрированный ответ животных на повреждающие воздействия включает также вегетативный (повышение артериального давления, увеличение частоты дыхания и сердечных сокращений, выделение из надпочечников гормонов тревоги - адреналина и норадреналина, и пр.), эмоциональный (страх, тревога), мотивационный (стремление изменить поведение) и другие компоненты.
Как показано в последние годы, у животных существует не только болевая (ноцицеп- тивная) система, но также эндогенная антиноцицептивная морфофункциональная система, поддерживающая и регулирующая порог болевой чувствительности на необходимом функциональном уровне. В ответ на болевой стимул одновременно с запуском немедленного поведенческого ответа происходит усиление активности противоболевой системы, по механизму обратной связи запускающей процессы, притупляющие боль.
Анальгетическая активность для исследованных рыб эндогенных опиодных пептидов β-казоморфина и дерморфина свидетельствует о существовании у рыб μ-опиоидной эндогенной антиноцицептиной системы. Подтверждением этого могут служить данные о том, что μ- и κ-опиатные рецепторы, опосредующие антиноцицептивные эффекты опиоидов, были обнаружены в мозгу золотой рыбки (Brooks et al., 1993) и в различных структурах мозга кижучей Oncorhynchus kisutch, проходящих смолтификацию (Ebbesson et al., 1993).
Как было показано ранее, дерморфин при введении в обонятельные мешки обладал значительной анальгетической активностью для крыс и вызывал аналгезию намного эффективнее, чем при внутрибрюшинных инъекциях (Батурина и др., 1988).
Представления о том, существует ли у рыб болевая чувствительность, находятся в широком диапазоне мнений - от полного отрицания таковой до существования у рыб осознанного восприятия боли (Sneddon, 2003). Стоит ли говорить о боли у рыб? Безусловно, да. Гуманное отношение к рыбам также обоснованно как и к другим животным, имеющим более сложную организацию головного мозга. У рыб нет слуховой коры, но они слышат, у них нет зрительной коры, но ни видят, у них нет обонятельной коры, но они чувствуют запахи. Наши эксперименты доказывают, что они также чувствуют болевые стимулы. Очевидно, бескорковым животным недоступны сочувствие и сострадание и т.п., но они испытывают чувство боли, запускающее рефлексы избегания как высшие позвоночные и люди. Имеются наблюдения, которые позволяют усомниться в том, что у рыб вообще существует болевая чувствительность, например, - пожирание акулой собственных внутренностей, выпадающих из вспоротого живота. Такие факты можно объяснить тем, что у голодных животных пищевая мотивация бывает настолько сильной, что происходит функциональная блокада пищевым возбуждением механизмов, участвующих в распространении болевых импульсов в центральные структуры. Конкурентная анальгезия локальных болевых воздействий возникает и при действии других экстремальных факторов, например, стресса, что мы также наблюдали в своих опытах.
Колебания порога боли, по-видимому, могут играть приспособительную роль, так как позволяют животным при необходимости удовлетворять жизненно важные потребности (пищевую или оборонительную), несмотря на действие повреждающих стимулов.Уменьшение болевой чувствительности под действием неопиоидных препаратов анальгина и сиднофена, а также анальгезия, вызываемая состоянием стресса свидетельствуют о том, что у рыб имеются, кроме опиоидной, и другие эндогенные системы обезболивания.
Таким образом, полученные данные позволяют считать, что у рыб существуют системы ноцицепции и антиноцицепции. Болевая чувствительностиь рыб имеет индивидуальную вариабельность по амплитуде и по характеру ответов, зависит от физиологического состояния особи и от сезона года.
До сих пор нет в существующих российских законах положений, детально регламентирующих условия содержания рыб. Постановление 1977 г. не рассматривает рыб, не прописаны правила обращения с ними. В федеральном законе «О животном мире» провозглашаются, но не прописаны правила охраны и использования объектов животного мира, содержащихся в полувольных условиях или искусственно созданной среде обитания (Никоноров, 2006). В проект федерального закона «Об аквакультуре» в раздел о способе содержания в искусственных, естественных и др. условиях следовало бы внести правила обращения с рыбами в условиях экспериментального и промышленного использования, учитывая, что некоторые манипуляции могут причинять им болезненные ощущения.
Отсутствие юридических ограничений на эксперименты с низшими позвоночными и , в частности, с рыбами, отнюдь не снижает актуальности разработки методов эффективного обезболивания при хирургическом вмешательстве или иных действиях, активизирующих но- цицептивную систему подопытных животных. Это касается как порядка проведения научных экспериментов, так и процедур промышленного характера, например, получения икры на осетровых рыбозаводах.
Работа поддержана грантами: РФФИ №06-04-49266, Ведущие научные школы НШ- 2104.2008.4.
Литература
Никоноров С.И. и др. 2006. Правовое регулирование деятельности в области аквакультуры // Вопр. рыболовства. Т. 7, N 3(27). С. 414-435.
Червова Л.С. 1997. Болевая чувствительность и поведение рыб // Вопр. ихтиологии. Т. 37, N 1. С. 106
111.
Червова Л.С., Каменский А.А., Малюкина Г.А. и др. 1992. Исследование механизма интраназального действия дерморфина у представителей двух классов позвоночных // Жур. эволюцион. биохим. физиол. Т. 28, N 1. С. 45-48.
Червова Л.С., Лапшин Д.Н. 2000. Опиоидная модуляция болевых порогов у рыб // Доклады АН. Т. 375, N 5. С. 703-704.
Червова Л.С., Лапшин Д.Н., Каменский А.А. 1994. Болевая чувствительность форели и аналгезия, вызываемая интраназально вводимым дерморфином // Доклады АН. T. 338, N 6. С. 836-837.
Brooks A.I., Standifer K.M., Ciszewska G.R. et al. 1993. Expression of κ-3 and μ binding sites in Bufo marinus (Giant toad) and Carassius auratus (Goldfish) brain // Soc. Neurosci. Abstr., Opioids: Recep., III. V. 19, N
5. P. 1156.
Ebbesson L.O.E., Daviche P., Ebbesson S.O.E. 1993. Distribution and changes in μ- and κ-opiate receptors in the midlife critical period of natural development in Coho salmon, Oncorhynchus kisutch // Abstr. Amer. Assoc. Anat., 106th Ann. Meet. Joint. Jpn. Assoc. Anat., San Diego, Calif., March 27-31, 1993, Anat. Rec. Suppl, P. 48.
Newby N.C. et al. 2008. Pharmacokinetics of morphine and its metabolites in freshwater rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) // J. Vet. Pharmacol. Therap. V. 31. P. 117-127.
Sneddon L.U. 2003. The evidence for pain in fish: the use of morphine as an analgesic // Applied Animal Behav. Sci. V.83. P. 153-162.
VIIth Congress on biology of fish. 2006. Canada. St.-John's, 18-22 July. Abstract Book, pp. 241.
BEHAVIORAL REACTIONS OF WHITE SEA COD ON THE NOCICEPTIVE STIMULATION L.S. Chervova
Dept. of Ichthyology, Faculty of Biology, Lomonosov Moscow State University,
Moscow, Russia, e-mail: lily_chervova@mail.ru
An originally optico-mechanical system was elaborated to record the behavioral responses to aversive stimuli in cod. The nociceptive stimulation (0.1-s train of 30 electric pulses of 0.5 ms each) and registration of the caudal peduncle moving were made synchronically. Nociceptive thresholds (NT) were measured at 5-min intervals for 1 h before and 1-2 h after administration of analgesic agents. Drugs used
were two μ-opioids dermorphin and β-casomorphin, and nonopioid agents sydnophenum, analginum,
novocainum. Drugs were administrated by different ways - intranasally, peritoneally, subcutaneously.
Administration of analgetics produced dose-dependent and lasting for at least 1 h (up to 2-3 h) increase of NT in 1.5-3.0 times. The higher the dose, the more quickly it acted. Local subcutaneous injections of 2% solution of novocainum blocked the nociceptive responses. Stress significantly reduced nociceptive responses in cod. Results suggest that fish as higher vertebrates have nociceptive and opioid and nonopioid antinociceptive systems; and its both take part in the control of fish behavior on the level of central mechanisms