ПАРАМЕТРЫ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ БЕЛОМОРСКОГО ФИТОПЛАНКТОНА ПРИ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКАХ АЗОТА

Т.А. Белевич, В.А. Осипов

Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, г. Москва, Россия e-mail: 3438083@list.ru

Первичная продукция в большинстве районов Мирового океана ограничена недостатком азо­та (Glibert, 1988).

Один из широко используемых подходов для определения эффективности световых реакций фотосинтеза - оценка параметров флуоресценции фотоавтотрофов. В частности, максимальная квантовая эффективность фотосистемы 2 (относительный выход переменной флуоресценции у адаптированных к темноте водорослей) отражает эффективность фотохимического преобразования энергии в реакционных центрах фотосистемы 2 (Falkowski, Raven, 1997). Этот параметр использу­ется в качестве характеристики физиологического состояния фитопланктона и его фотосинтетиче­ской активности (Falkowski, Raven, 1997). Ранее нами была исследована динамика параметров флуоресценции после внесения добавок органического (мочевина, глицин) и минерального (нитра­ты, аммоний) азота в лимитированные по азоту культуры морских планктонных водорослей Pseudo-nitzschia delicatissima, Thalassiosira weissflogii и Tetraselmis viridis, акклимированных к ли­митирующей и насыщающей фотосинтез освещенности (Ильяш и др., 2007).

В природных экосистемах концентрация Nopr изменяется значительно как во времени, так и в пространстве. Значимую долю в Nopr составляют вещества, которые планктонные водоросли спо­собны ассимилировать. Например, в летний период доля азота мочевины в суммарном содержании Nopr может достигать 48%, а доля азота свободных аминокислот - более 25% (Flynn, Butler, 1986). В природных экосистемах фитопланктон в поверхностном слое испытывает стресс фотоингибирова­ния, на промежуточных глубинах фотической зоны освещенность близка к насыщающему фотосин­тез уровню, на нижней границе фотической зоны освещенность лимитирует фотосинтез. Различная обеспеченность фитопланктона световой энергией, а также зависимость скорости потребления во­дорослями мочевины и аминокислот от освещенности (Bonin et al., 1982; Wallen, Allan, 1987) вы­двигают в качестве актуальных задач исследование динамики параметров флуоресценции у водо­рослей, ассимилирующих Nopr при разных уровнях освещенности. Особую актуальность такой под­ход приобретает в свете ежегодного возрастания количества поступающего в водные экосистемы органического азота антропогенного происхождения (Seitzinger, Sanders, 1999).

В настоящем исследовании проведен сравнительный анализ динамики параметров флуорес­ценции экспериментальных сообществ фитопланктона Белого моря при ассимиляции нитратов, ам­мония, глицина и мочевины при двух уровнях освещенности.

Материалы и методы

Эксперименты проводили на Беломорской биологической станции Московского государст­венного университета (Карельский берег Кандалакшского залива Белого моря) с 23 августа по 10 сентября 2007 г.

Схема экспериментов. Фитопланктон, служивший исходным материалом для экспери­ментов, отбирали с помощью сети из планктонного газа № 78 в слое 2-5 м. Для устранения пресса выедания растительноядным зоопланктоном фитопланктон пропускали через планктон­ный газ № 40. В 1.5 литровые пластиковые ёмкости добавляли отфильтрованную морскую воду, концентрированный фитопланктон (посевной титр - 1150 кл/мл, 2940 мкгС/л), а так же все био­генные элементы, за исключением азота, согласно прописи среды f/2 (Guillard, Ryther, 1962). Азот вносили в виде мочевины, глицина, нитратов или аммония в концентрации 180 мкмоль азота/л. Соотношение содержания азота и фосфора в среде равнялось пяти, что согласно обще­принятым взглядам (Ryther, Dunstan, 1971), обусловливает ограничение развития водорослей недостатком азота. В качестве контроля использовали фитопланктон без добавок азота. Экспе­риментальные емкости экспонировали in situ на плотиках на глубине 1 м. Полуденная освещен­ность на этой глубине (E1) колебалась в пределах 25 - 1050 мкЕ/(м² сек). Более низкую осве­щённость (E2), составлявшую в среднем 51 % от E1, создавали путём экранирования склянок тканью средней плотности.

Все варианты эксперимента проводили в трёх повторностях. При дальнейшем изложении со­общества, росшие с использованием разных источников азота, обозначены следующим образом: со­общество, ассимилирующее нитраты - N, глицин - G, мочевину - M, аммоний - A. Контрольное со­общество (без добавок азота) обозначено как K.

Параметры флуоресценции фитопланктона оценивали с использованием флуорометра WaterPAM (Walz, Германия) по методологии быстрых световых кривых (Rapid Light Curves, RLCs) (Schreiber et al., 1997; Ralph, Gademann 2005). Для каждого экспериментального сообщества пара­метры флуоресценции измеряли на одной подпробе при последовательном увеличении (от нуля) интенсивности света, генерируемого в флуорометре WaterPAM.

Квантовую эффективность фотосистемы 2 (ФС2) измеряли при насыщающей вспышке 5000 мкЕ/(м² с) продолжительностью 0,8 с, генерируемой флуорометром. Флуорометр регист­рирует следующие показатели: Fo и Fm (у клеток, акклимированных к темноте), F'm и Ft (у кле­ток, подвергшихся освещению светом определенной интенсивности). На основе этих показа­телей флуорометром WaterPAM автоматически рассчитываются следующие параметры:

1) Максимальная квантовая эффективность ФС2 F_v/ F_m = (F_m - F_o)/F_m, где F_o - минимальный выход флуоресценции, измеренный непосредственно перед насыщающей вспышкой.

2) Фотохимическая эффективность ФС2 клеток, освещаемых в течение 30 с светом опреде­ленной интенсивности Φ_φ(2. Φ_φ(2 = (F'_m - F_t)/ F'_m (Genty et al. 1989), где F_t - выход флуоресценции при данной интенсивности света, измеренный непосредственно перед насыщающей вспышкой. Па­раметр Φ_φ(2 отражает долю световой энергии, используемой в фотохимических реакциях от свето­вой энергии, поглощенной хлорофиллом ФС2.

3) Нефотохимическое тушение флуоресценции NPQ = (Fm - F'm)/ F'm . Величина NPQ характе­ризует рассеивание световой энергии в виде тепла (Schreiber, 2004).

4) Относительная скорость нециклического электронного транспорта при определенной ин­тенсивности света rETR = Φ_φ(2 · 0,5 · E₁, где E₁ - освещенность, мкЕ/(м² с). Принимается равное рас­пределение световой энергии между ФС2 и ФС1 (Sakshaug et al., 1997).

Соотнесение каждой интенсивности света значения rETR дает так называемые быстрые световые кривые (Schre1ber et al., 1997; Ralph, Gademann 2005), обозначаемые далее как Р/Е кривые.

Результаты и обсуждение

После внесения добавок азота во всех сообществах наблюдалось увеличение суммарной био­массы водорослей, превосходящее таковое в контроле. Увеличение биомассы продолжалось до 6 сут при E1 и до 9 сут при E2. Величина накопленной биомассы фитопланктона зависела от источни­ка азота и уровня освещенности (Белевич, 2009).

По мере роста экспериментальных сообществ изменялись параметры флуоресценции водо­рослей, при этом динамика параметров флуоресценции зависела от источника азота и освещенности (табл.).

На стадии активного роста с первых по шестые сутки максимальная квантовая эффективность

ФС2 (F_v/F_m) изменялась в пределах 0,64 - 0,71. Такие величины свидетельствуют о хорошем физио­логическом состоянии водорослей (Kromkamp et al., 1998) в экспериментальных сообществах, а так­же о том, что водоросли не лимитированы недостатком азота (Parkhill et al., 2001).

Сопоставление величин максимальной относительной скорости фотосинтетического транс­порта электронов (rETRmax) водорослей, ассимилирующих глицин, мочевину и нитраты при двух уровнях освещенности, дает картину аналогичную отмеченной для P/B (Белевич, 2009). В сообще­ствах, росших с использованием аммония, в отличие от соотношения величин P/B, rETRmax было выше при E2, чем при E1 на протяжении всего периода увеличения биомассы.

Динамика коэффициента максимальной утилизации световой энергии α практически не зави­села от добавки азота.

Таблица

Динамика максимальной квантовой эффективности ФС2 (F_v/F_m), максимальной относительной скоро­сти фотосинтетического транспорта электронов (rETRmax), коэффициента максимальной утилизации световой энергии (α), нефотохимического тушения при интенсивности света 401 мкЕ/(м² с) (NPQ) у во­

дорослей, росших с добавками нитратов (N), мочевины (M), глицина (G) и аммония (A) при освещенно­сти E1 и E2.

Динамика нефотохимического тушения (NPQ) зависела от ассимилируемого субстрата и уровня ос­вещенности. Значения NPQ при увеличении интенсивности фотосинтетически активной радиации возрас­тали более резко в сообществах G за исключением первых суток при E1 и шестых суток при E2. При всех добавках и обеих освещенностях с первых по третьи сутки значения NPQ снижались, а по мере достиже­ния водорослями максимальных значений биомассы (на 6-е и 9-е сутки) снова возрастали. Это согласует­ся с выявленной ранее зависимостью NPQ от стадии роста водорослей (Arsalane et al., 1994).

В большинстве случаев значения NPQ у водорослей, росших при E1, были выше таковых при E2. Исключение составили сообщества G в 1-е сутки и А на 3-и сутки. В экспериментальных сооб­ществах по числу видов и биомассе преобладали диатомовые водоросли (Белевич, 2009). У диато­мовых водорослей основной компонентой NPQ является энергозависимое тушение (qE) в ксанто- фильном цикле (Casper-Lindley, Bjorkman, 1998). Электронный транспорт между двумя фотосисте­мами индуцирует градиент протонов через тилакоидную мембрану. Соответствующее подкисление лумена ведет к превращению диадиноксантина в диатоксантин, который рассеивает избыточную энергию в виде тепла (Casper-Lindley, Bjorkman, 1998; Lavaud et al., 2004). Амплитуда и кинетика NPQ у диатомей зависит от уровня освещенности, при котором растут водоросли (Lavaud et al., 2003) и выше у адаптированных к более высокой освещенности клеток (Perkins et al., 2006). Более высокие значения NPQ при E1, чем при E2 согласуются с тем, что в большинстве случаев макси­мальная относительная скорость фотосинтетического транспорта электронов отмечались при более низкой освещенности. Помимо зависимости от освещенности для диатомей показана видоспеци­фичность амплитуды и кинетики NPQ (Lavaud et al., 2004). Соответственно, видоспецифическая эф­фективность использования отдельными видами водорослей разных азотсодержащих субстратов (Fan et al., 2003), обусловливает зависимость NPQ сообществ от источника азота и освещенности.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 08-04-00932).

Литература

Белевич Т.А., 2009. Продукционные характеристики фитопланктона Белого моря в зависимости от ис­точника азота. Настоящий сборник.

Ильяш Л.В., Житина Л.С., Федоров В.Д., 2003. Фитопланктон Белого моря. М.: Янус-К. 168 c.

Ильяш Л.В., Белевич Т.А., Уланова А.Ю., Маторин Д.Н., 2007. Флуоресцентные параметры морских планк­тонных водорослей при ассимиляции органического азота // Вестник Московск. ун-та. Сер. 16, № 3. С. 17-22.

Максимова М.П., 1991. Гидрохимия Белого моря // Гидрометеорология и гидрохимия морей СССР. Т.2. Белое море. Ч.1. С. 8-193.

Antia N.J., Harrison J.P., Oliveira L., 1991. The role of dissolved organic nitrogen in phytoplankton nutrition, cell biology and ecology // Phycologia. V. 30. P. 1-89.

Arsalane W, Rousseau B, Duval J-C., 1994. Influence of the pool size of the xanthophyll cycle on the effects of light stress in a diatom: competition between photoprotection and photoinhibition // Photochem. Photobiol. V. 60. P. 237-243.

Bonin D.J., Antia N.J., Pelaez-Hudlet J., 1982. Influence of temperature and light intensity on the utilization of glycine as nitrogen source for phototrophic growth of marine unicellular cyanophyte (Cyanobacterium) // Bot. Mar. V. 25. P. 493-499.

Casper-Lindley C., Bjorkman O., 1998. Fluorescence quenching in four unicellular algae with different light­harvesting and xanthophyll-cycle pigments // Photosynth. Res. V. 56. P. 277-289.

Falkowski P.G., Raven J.A., 1997. Aquatic photosynthesis. Malden: Blackwell Science. 375 p.

Fan C., Glibert P.M., Lomas M.W., 2003. Characterization of urease activity in three marine phytoplankton species, Aureococcus anophagerefferens, Prorocentrum minimum, and Thalassiosira weissflogii // Mar. Biol. V. 142. P. 949-958.

Flynn K.J., Butler I., 1986. Nitrogen sources for the growth of marine microalgae: role of dissolved free amino acids // Mar. Ecol. Progr. Ser. V. 34. P. 28-304.

Genty B., Briantais J-M., Baker N.R., 1989. The relationship between the quantum yield of photosynthetic electron transport and quenching of chlorophyll fluorescence // Biochim. Biophys. Acta. V. 990. P. 87-92.

Glibert P.M., 1988. Primary productivity and pelagic nitrogen cycling // Nitrogen cycling in coastal marine environments / Eds. T.H. Blackburn, J. Sorensen. N. Y. P. 3-31.

Guillard R. R. L., Ryther J. H., 1962. Studies on marine diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran. // Can. J. Microbiol. V. 8. P. 229-239.

Harris I. Muhlstein, Tracy A. Villareal, 2007. Organic and inorganic nutrient effects on growth rate-irradiance relationships in the texas brown-tide alga Aureoumbra lagunensis (Pelagophyceae) // J. Phycol. V. 43 (6). P. 1223-1226.

Jassby A.D., Platt T., 1976. Mathematical formulation of the relationship between photosynthesis and light for phytoplankton // Limnol. Oceanogr. V. 21. P. 540-547.

Kromkamp J., Barranguet C., Peene J., 1998. Determination of microphytobenthos PSII quantum efficiency and photosynthetic activity by means of variable chlorophyll fluorescence // Mar. Ecol. Prog. Ser. V.162. P. 45-55.

Lavaud J., Rousseau B., Etienne A-L., 2003. Enrichment of the lightharvesting complex in diadinoxanthin and

implications for the non-photochemical fluorescence quenching in diatoms // Biochemistry. V. 42. P. 5802-5808.

Lavaud J, Rousseau B, Etienne A-L., 2004. General features of photoprotection by energy dissipation in planktonic diatoms (Bacillariophyceae) // J. Phycol. V. 40. P. 130-137.

MacInture H.L., Kana T., Anning T., Geider R., 2002. Photoacclimation of photosynthesis irradiance response curves and photosynthetic pigments in microalgae and cyanobacteria // J. Phycol. V. 38. № 1. P. 17-38.

Parkhill J-P., Maillet G., Cullen J.J., 2001. Fluorescence-based maximal quantum yield for PSII as a diagnostic of nutrient stress // J. Phycol. V. 37. P. 517-529.

Perkins R.G., Mouget J-L., Lefebvre S., Lavaud J., 2006. Light response curve methodology and possible implications in the application of chlorophyll fluorescence to benthic diatoms // Mar. Biol. V. 149. P. 703-712.

Ralph P.J., Gademann R., 2005. Rapid light curves: a powerful tool to assess photosynthetic activity // Aquat. Bot. V. 82. P. 222-237.

Ryther J., Dunstan W.M., 1971. Nitrogen, phosphorus and eutrophication in the coastal marine environment // Science. V. 171. P. 1008-1013.

Sakshaug E., Bricaud A., Dandonneau Y., Falkowski P.G., Kiefer D.A., Legendre L., Morel A., Parslow J., Takahashi M., 1997. Parameters of photosynthesis: definitions, theory and interpretation of results // J. Plankton. Res.

V. 19. P. 1637-1670.

Schreiber U., 2004. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) fluorometry and saturation pulse method: an overview // Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis / Eds. G.C. Papageorgiou, Godvindjee. Kluwer Acad. Publ. Dordrecht The Netherlands. P. 279-319.

Schreiber U., Gademann R., Ralph P.J., Larkum A.W.D., 1997. Assessment of photosynthetic performance of Prochloron in Lissoclinum patella in hospite by chlorophyll fluorescence measurements // Plant Cell Physiol. V. 38. P. 945-951.

Seitzinger S.P., Sanders R.W., 1999. Atmospheric input of dissolved organic nitrogen stimulate estuarine bacteria and phytoplankton // Limnol. Oceanogr. V. 44. P. 721-736.

Wallen D.G., Allan R., 1987. Utilization of amino acids by blue-green alga Synechococcus AN (Anacystis nidulans) // Can. J. Botany. V.65. P. 1133-1136.

FLUORESCENCE PARAMETERS OF THE WHITE SEA PHYTOPLANKTON IN DIFFERENT SOURCE OF NITRATE

Т.А. Belevich, V.A. Osipov

Moscow State University, Moscow, Russia e-mail: 3438083@list.ru

Phytoplankton was sampled in the Kandalaksha Bay of the White Sea in the end of august, 2007. The samples were kept 14 days in situ under two levels of irradiance (Е1>Е2) with additions of nitrogen in form of urea (U), glycine (G), nitrate (N) and ammonium (A). using fluorometer WaterPAM The following fluorescence parameters were estimated every 3rd day: the maximum PSII efficiency (Fv/Fm), the maximum relative electron transport rate (rETRmax), coefficient of maximum photosynthetic efficiency (α) and non-photochemical quenching coefficient under light level 401 mkE/m2s (NPQ). During the active growth period (from day 1 to day 6) Fv/Fm changed in range from 0,64 to 0,71. In A communities rETRmax was higher under E2, than under E1 during all period of biomass growth. The α coefficient dynamics didn't show any dependence on the nitrogen additions. The NPQ dynamics depended on nitrogen source and irradiance level.