ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ КОРМОВОЙ БАЗЫ РЫБ ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА

Н.М. Калинкина, М.Т. Сярки, Е.В. Теканова, Т.А. Чекрыжева, Т.М. Тимакова,

Т.Н. Полякова, А.В. Рябинкин

Учреждение Российской академии наук Институт водных проблем Севера Карельского научного центра РАН, г.

e-mail: kalina@nwpi.krc.karelia.ru Введение

Важнейшим направлением гидробиологических исследований является оценка биоресурсно­го потенциала водных экосистем (Алимов и др., 2005). Точное количественное определение вылова рыбы возможно с использованием продукционного подхода, который предполагает исследование закономерностей передачи вещества и энергии через трофические звенья экосистемы (Винберг, 1960; Алимов, 1989; Алимов, 2000). В более ранних исследованиях рассчитывались элементы био­тического баланса для отдельных районов Онежского озера (Экосистема Онежского озера и тенден­ции ее изменения, 1990; Онежское озеро, 1999). В настоящей работе впервые выполнен расчет био­тического баланса для экосистемы Онежского озера в целом, при этом в расчет включено высшее звено экологической пирамиды - рыбы.

Цель настоящих исследований заключалась в изучении трофической структуры и рыбопро­дуктивности экосистемы Онежского озера. Задачи, которые решали в ходе исследования: оценить первичную продукцию фитопланктона; оценить современное состояние сообществ бактерио-, фито­, зоопланктона, бентоса как основы для формирования кормовой базы рыб; оценить возможную ры - бопродукцию Онежского озера.

Материалы и методы

В работе представлены данные по планктонной системе Онежского озера за 1988-2006 гг.; данные по макрозообентосу - за 2001-2006 гг. Использовали показатели численности, биомассы и продукции основных компонентов экосистемы Онежского озера. В расчетах применяли уравнения зависимости рыбопродукции от гидробиологических показателей (Китаев, 1984; 2007), а также ба­лансовую модель, описывающую трофические связи и потоки энергии между компонентами пре­сноводных экосистем (Бульон, 2005).

Результаты и обсуждение

Выполнен анализ видовой и размерной структуры, а также динамики показателей количест­венного развития (численность, биомасса) фитопланктона, важнейшего компонента биоресурсной базы Онежского озера. Для оценки промыслового вылова рыбы по биомассе фитопланктона ис­пользовали регрессионное уравнение:

P = 4,546 Вф °·⁶⁹¹,

где P - промысловый вылов, кг/га в год; Вф - биомасса фитопланктона, г/м³.

Расчеты показали, что промысловый вылов в Онежском озере будет составлять 1,5-2,7 тыс. тонн в год, что соответствует наблюдаемым величинам уловов в 1946-1995 годах (Кудерский и др., 1997).

По показателям первичной продукции фитопланктона Онежское озеро в целом представляет собой олиготрофный водоем, за исключением эвтрофируемых Кондопожской и Петрозаводской губ, где продукция фитопланктона достигает показателей мезотрофных вод.

Была выполнена оценка вклада этих заливов в первичное продуцирование водоема с учетом площадей (табл. 1). Годовая продукция фитопланктона Кондопожской и Петрозаводской губ дости­гает 11,7-18,7 (среднее 14,6) тыс. тонн органического углерода, а с площади озера в целом с учетом этих заливов - 15°,6-2°7,4 (среднее 172,1) тыс. тонн. Таким образом, участие эвтрофируемых зали­вов в первичном продуцировании Онежского озера можно оценить в среднем примерно в 9%.

Таблица 1

Вклад Кондопожской и Петрозаводской губ в первичную продукцию Онежского озера с учетом площадей, тыс . тонн С в год

Годовая продукция фитопланктона в Онежском озере достигает 14°-21°° тыс.

Для расчетов использовали соотношение, согласно которому уловы рыб в водоемах озерного типа составляют °,2% от продукции фитопланктона (Бульон, Винберг, 1981; Бульон, 2°°5; Китаев, 1984, 2°°7). Согласно полученным данным, общий улов без ущерба для рыбного сообщества в Онежском озере может составлять 2,9-4,1, в среднем 3,3±°,2 тыс. тонн. Годовая рыбопродукция со­ставляет около 9 тыс. тонн в год.

В Онежском озере, в связи со значительным поступлением аллохтонного органического ве­щества, на продуктивность зоопланктона и бентоса заметное влияние оказывает уровень развития бактерий. За исключением наиболее освоенных и антропогенно эвтрофируемых северо-западных губ (Кондопожской и Петрозаводской, Большой губы Повенецкого залива) в глубоководной части акватории озера численность бактерий в летний период достигает °,5-1,°3, в среднем - °,79 млн./мл, что определяет формирование здесь небольших величин бактериальной биомассы - °,17- °,34 г/м³, в среднем °,26 г/м³. В весенний период, который продолжается вплоть до июля, числен­ность и биомасса бактерий характеризуются еще меньшими значениями. Лишь в губах, загрязняе­мых промышленными и хозяйственно-бытовыми стоками (Кондопожская, Петрозаводская, Боль­шая губа Повенецкого залива), в составе которых значительную долю составляет органическое ве­щество, численность и биомасса бактерий возрастает в 2-2,5 раза.

Для характеристики ресурсных возможностей развития кормовой базы зоопланктона в Онеж­ском озере представлены данные по распределению биомасс бактериопланктона на акватории озера и их соотношение с биомассой фитопланктона. Показано, что гетеротрофное звено в питании зоо­планктона имеет значение, сопоставимое с фитопланктоном. Особенно возрастает роль бактерий, как пищевого ресурса зоопланктона, в осенне-зимний период, когда продукционная активность фи­топланктона снижается до минимальных значений, а в подледный период -практически до нуля.

Звено зоопланктона является неотъемлемой частью экосистемы водных объектов. Крупные олиготрофные озера, такие как Онежское, имеют экосистему планктонного типа, т.е. основные по­токи органического вещества и энергии от продуцентов к высшим трофическим звеньям идут имен­но через зоопланктонные сообщества простейших, коловраток и ракообразных. Распределение ко­личественных показателей зоопланктона по акватории озера определяется температурными и дина­мическими условиями. В центральной части озера, в глубоководных заливах Большое Онего и По- венецком, количественные показатели обычно не превышают 20 тыс. экз./м³, биомасса - менее 1 г/м³ и соответствуют олиготрофному статусу системы. В губах показатели обычно выше, до 1,5-2 г/м³. Максимальные величины отмечены для антропогенно-трансформированного района, вершин­ной части Кондопожской губы (до 6 г/м³). Рассмотрены основные закономерности сезонной дина­мики зоопланктона, многолетняя динамика его биомассы для различных участков, дана оценка про­дукции зоопланктона для центрального района и эвтрофируемых заливов Онежского озера.

Для оценки уловов рыб по биомассе зоопланктона было применено уравнение (Коваль, Ка­занский, 1984):

Y=4.408*X0^.698 ,

где Y, кг/га - вылов рыбы; X, г/м³ - биомасса зоопланктона. Если принять среднюю летнюю биомассу зоопланктона за 0,3-0,5 г/м³, то предположительные уловы будут равны 1,90-2,7 кг/га или около 2-2,5 тыс.т. на все озеро. При более высоких биомассах в губах, например в Петрозаводской губе (1-1,5 г/м³), оценки уловов увеличиваются от 4,5 до 5,8 кг/га. Таким образом, рыбопродукция превышает 6 кг/га или 6-7.5 тыс. тонн на все озеро.

Для оценки продуктивности макрозообентоса было изучено пространственное распределение его численности и биомассы в различных районах озера. Средние численность и биомасса зообен­тоса в профундальных районах (например, центральном плесе) достигают 1,66 тыс. экз./м² и 3,30 г/м², в эвтрофируемых заливах эти показатели в несколько раз больше - 7.3-8.3 тыс.

В связи с появлением в озере вселенца - байкальской амфиподы Gmelinoides fasciatus Stebbin - заметно изменилась ситуация в литоральной зоне Онежского озера. По результатам исследований 2005-2006 гг., инвазивный вид G. fasciatus обнаружен практически на всех прибрежных участках Онежского озера. Максимальные значения вклада вселенца достигают 84% от общей биомассы макрозообентоса литоральных ценозов.

Был выполнен расчет потенциальной рыбопродукции по кормовой базе двумя способами, ис­пользуя уравнения Р' = Рб x1/U*K2« Ке ; и Р' = Рб/КК * Ке,

где Р' - продукция рыб, Рб - «чистая» (без рациона хищных животных) продукция кормовых организмов, 1\U - усвояемость корма рыбами = 0,8; К2 - коэффициент эффективности использова­ния ассимилированной пищи на рост = 0,3. Ке - коэффициент максимально возможного использо­вания рыбой кормовых организмов, принятый равным 0,5; КК - кормовой коэффициент.

«Чистая» продукция кормовых организмов, рассчитанная на основе физиологического мето­да, равна 12,33 г/м². Продуктивность ихтиоценоза, рассчитанная по продукции зообентоса, состав­ляет от 12.2-18.0 кг/га или 4.9-7.5 тыс. т. в год. Ориентировочные расчетные уловы при условии 30% изъятия без ущерба для популяций бентосоядных рыб, составят 1.5-2.5 тыс. тонн в год.

Эффективным методом изучения биотического баланса Онежского озера является моделиро­вание. Нами была рассмотрена балансовая модель В.В. Бульона (2005), которая включает в себя описание наиболее общих закономерностей функционирования биоты пресноводной экосистемы и ее связи с факторами среды. Модель содержит 70 уравнений, имеется 5 входных параметров. Мо­дель рассчитывает первичную продукцию и перераспределение энергии по трофическим уровням экосистемы - от фитопланктона до рыб.

Входные данные для Онежского озера составляют: содержание фосфора - 12 мкг/л, цветность - 20 град., географическая широта - 62 град., средняя глубина - 30 м, максимальная глубина - 120 м. Первое использование модели выявило несоответствие расчетных данных реальным: была рас­считана в 2-3 раза большая продукция фитопланктона, чем наблюдается в действительности. Ана­лиз данных показал, что причиной такого несовпадения является особенность формирования пер­вичной продукции фитопланктона в Онежском озере. Так, средневегетационная фотосинтетическая активность хлорофилла составляет лишь 13 мгС/мгСЫ, в то время как в модели эта величина была существенно выше - 30 мгС/мгСЫ. Существенно меньшая интенсивность фотосинтеза связана с до­минированием в фитопланктоне Онежского озера крупных диатомовых водорослей.

После изменения коэффициента интенсивности фотосинтеза были рассчитаны показатели продукции для разных компонентов экосистемы Онежского озера (табл. 2).

Таблица 2

Сравнение эмпирических данных и модельных расчетов для различных компонентов биотического баланса в Онежском озере

Примечания: В - биомасса; Р - продукция; ПП - первичная продукция фитопланктона.

В таблице 2 представлены эмпирические данные и модельные расчеты величин по биомассе и продукции основных компонентов экосистемы Онежского озера. Модель воспроизводит биомассу и продукцию фитопланктона, близкую к реальным данным. Хорошо совпадают и данные по зоо­планктону. Заметное различие между расчетными и эмпирическими данными обнаружилось для со­общества макрозообентоса, что можно объяснить высокой пространственной гетерогенностью это­го компонента, которую модель не учитывает. Особый интерес представляют расчеты ихтиопро- дукции, которые составили 0.57 ккал/м² или около 11 тыс. тонн на озеро в год. Уловы рыб в Онеж­ском озере составляют около 20 % от рыбопродукции.

Выводы

Особенности Онежского озера - большие размеры, холодноводность, существенная роль ал­лохтонного вещества в функционировании экосистемы - определяют характерные свойства его флоры и фауны и, в конечном счете, уровень рыбопродукции экосистемы.

Фитопланктон является основой потока вещества и энергии в Онежском озере, создавая боль­шую часть всей первичной продукции. Основная доля биомассы водорослей и их продукции синте­зируются в глубоководном центральном плесе, достигая по биомассе 0.2-0.6 г/м³; по продукции - 80-130 г С/м² в год. По сравнению с этим районом более продуктивные Петрозаводская и Кондо­пожская губы составляют лишь около 2% от запаса биомассы. Продукция фитопланктона в этих за­ливах не превышает 9% от общей для водоема. Для видового состава фитопланктона характерна значительная роль холодолюбивых диатомовых водорослей, что определяет относительно низкую фотосинтетическую активность фитопланктоценозов. Бактериопланктон не является кормовым ре­сурсом для рыб, однако составляет пищевую основу протозойного и метазойного планктона. Усваи­вая отмирающий фитопланктон и аллохтонное органическое вещество, бактерии передают энергию на высшие гетеротрофные уровни. В пелагической системе роль бактериопланктона в питании зоо­планктона сопоставима с фитопланктоном. Однако в литоральной зоне доминирующее значение принадлежит планктонным водорослям. Зоопланктон Онежского озера представляет собой важней­шее звено в передаче энергии от первичных продуцентов к рыбам. Это подтверждается данными по структуре уловов: доля рыб-планктофагов в них составляет около 80%.

Анализ гидробиологических данных показал, что Онежское озеро на основной части своей акватории в течение последних 50-ти лет продолжает сохранять исходный олиготрофный статус. Это свидетельствует о стабильности кормовой базы рыб. Отдельные глубоководные районы озера (Большое Онего), находятся на начальных стадиях эвтрофированиия, которое сопровождается рос­том биомассы зоопланктона и бентоса за счет особенно ценных в кормовом отношении видов и ве­дет к увеличению кормовой базы. В результате стихийного вселения байкальской амфиподы суще­ственно (почти в 1.5 раза) повысилась продуктивность литорали Онежского озера.

Проведенные расчеты возможных уловов рыб на основе современных данных по продукции фитопланктона, биомассе фитопланктона и зоопланктона, продукции зообентоса Онежского озера показали, что объем вылова рыбы может быть не меньше, чем в наиболее урожайные годы. Так, по величине продукции фитопланктона общий улов без ущерба для рыбного сообщества в Онежском озере может составлять 2.9-4.1, в среднем 3.3±0.2 тыс. тонн в год. Расчеты по биомассе фитопланк­тона показали, что промысловый вылов в Онежском озере может составлять 1,5-2,7 тыс. тонн в год. По величине средней летней биомассы зоопланктона уловы составляют около 2-2.5 тыс. тонн на все озеро. Ориентировочные возможные уловы бентосоядных рыб могут составлять 1.5-2.5 тыс. тонн в год. Расчеты рыбопродукции, выполненные при использовании модели В.В. Бульона (2005), представляют собой величины, соизмеримые с данными, полученными по уравнениям регрессии для отдельных гидробиологических показателей (6-11 тыс. тонн в год).

Таким образом, оценки потенциальных уловов с использованием различных гидробиологических показателей оказались очень близкими друг к другу, что подтверждает корректность выполненных расче­тов и позволяет их использовать для дальнейших прогнозов возможных уловов рыбы в Онежском озере.

Литературв

Алимов А.Ф., 1989. Введение в продукционную гидробиологию. Л.: Гидрометеоиздат. 151 с.

Алимов А.Ф., 2000. Элементы теории функционирования водных экосистем. СПб.: Наука. 147 с.

Алимов А.Ф., В.В. Бульон, С.М. Голубков, 2005. Динамика структурно-функциональной организации экосистем континентальных водоемов / Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами. Сборник научных статей. Москва: Товарищество научных изданий КМК. С. 241-253.

Бульон В.В., 2005. Моделирование потоков энергии в озерных экосистемах как инструмент гидробио­логических исследований // Водные ресурсы. Т. 32, № 3. С. 361-370.

Бульон В.В., Винберг Г.Г., 1981.Соотношение между первичной продукцией и рыбопродуктивностью водоемов // Основы изучения пресноводных экосистем. Л.: Наука. С. 5-10.

Винберг Г.Г., 1960. Первичная продукция водоемов. Минск: Изд-во АН БССР. 328 с.

Китаев С.П., 1984. Экологические основы биопродуктивности озер разных природных зон. М.: Наука. 207 с.

Китаев С.П., 2007. Основы лимнологии для гидробиологов и ихтиологов. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН. 395 с.

Коваль В.П., Казанский А.Б., 1984. Эмпирический подход к прогнозированию рыбопродуктивности проектируемых водохранилищ // Вопросы прогнозного обеспечения рыбного хозяйства на внутренних водо­емах. Л. С. 119-134.

Онежское озеро. Экологические проблемы, 1999. / Под ред. Н.Н. Филатова. Петрозаводск: Изд-во КарНЦ РАН. 293 с.

Экосистема Онежского озера и тенденции ее изменения, 1990. Л.: Наука. 264 с.

THE PECULIARITIES OF FISH FOOD BASE FORMING IN LAKE ONEGO

N.M. Kalinkina, M.T. Syarki, E.V. Tekanova, T.A. Tchekryzheva, T.M. Timakova,

T.N. Polyakova, A.V. Ryabinkin

Northern Water Problems Institute, Karelian Research Centre, RAS, Petrozavodsk, Russia e-mail: kalina@nwpi.krc.karelia.ru

An attempt to assess of Lake Onego productivity is presented. The production-based approach, which investigates the transfer of matter and energy through the food chains, was used. For the first time, the biotic balance for Lake Onego ecosystem was calculated, including fish. In this work the data on the plankton system in Lake Onego in 1988-2006 were used; data on macrozoobenthos were obtained in 2001-2006. The

estimation of phytoplankton primary production, the assessment of current status of bacterial, phyto-, zooplankton, benthos communities and their production characteristics were carried out. Fish production was calculated by two methods. Firstly, the equations describing dependence of fish production on hydrobiological parameters (Kitaev 1984, 2007) was applied. Secondly, the balance model describing trophic relations and energy fluxes through components of the freshwater ecosystem by V.V. Boulion (2005) was employed.

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ Са²⁺-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ MYTILUS EDULIS L. В ЭКСПЕРИМЕНТАХ IN VITRO И IN VIVO

Н. П. Канцерова ¹, Л. А. Лысенко ¹, Н. Н. Немова ^1,2, В. В. Осташкова ^{2 1}Учреждение Российской Академии наук Институт биологии Карельского научного центра РАН, г. Петроза­водск, Россия

² Петрозаводский государственный университет, г . Петрозаводск e-mail: nkantserova@yandex.ru

Тяжелые металлы (ртуть, кадмий, свинец, медь, цинк и некоторые другие) - одни из основ­ных поллютантов, поступающих в морскую среду, главным образом, с атмосферными осадками и в процессе таяния снега. Им свойственны высокая биологическая активность, способность к аккуму­ляции в организме без уменьшения токсичности, легкость биопереноса в окружающей среде. Все возрастающее антропогенное загрязнение различных экосистем, в том числе морских, делает акту­альным изучение механизмов воздействия тяжелых металлов на организмы.

Известно, что токсичность тяжелых металлов, в основном, определяется их ингибирующим действием на ферментативную активность. Комплексы ферментов с ионами тяжелых металлов ус­тойчивы, и ингибирование принимает необратимый характер. Так, ионы тяжелых металлов могут образовывать прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими тио- (SH-) или алкилтиогруппировки (RS-). К типу цистеиновых (содержащих SH-группы цистеина в ак­тивном центре) протеиназ относятся кальпаины, или Са²⁺-зависимые протеолитические ферменты цитозоля. В эксперименте in vitro продемонстрировано (Ladrat et al., 2002), что ионы кобальта, ни­келя, кадмия и ртути вызывают полную инактивацию кальпаинов из тканей рыб. Однако, по всей видимости, механизм взаимодействия ионов металлов с изучаемыми цистеиновыми протеиназами может реализовываться не только за счет SH-групп их активного центра, но и за счет конкуренции этих ионов с кальцием на кальций-зависимых этапах функционирования кальпаинов. Так, способ­ность некоторых металлов (стронция, бария) активировать кальпаины, аналогично кальцию, также была продемонстрирована в эксперименте in vitro (Ladrat et al., 2002).

В практике биохимического мониторинга большой интерес представляет изучение свойств и уровня активности Са²⁺-зависимых протеолитических ферментов при действии тяжелых металлов in vivo. Как указывалось выше, SH-группы активного центра кальпаинов могут выполнять роль спе­цифичных лигандов для ионов тяжелых металлов, кроме того, ионы металлов главной подгруппы II группы (стронция, бария) могут замещать кальций - основной регулятор активности кальпаинов.

В ранее проведенных экспериментах нами неоднократно было показано, что внутриклеточные протеолитические ферменты, в том числе кальпаины, играют важную роль в развитии физиолого-био­химической адаптации живых организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. Такая адап­тация подразумевает не только синтез новых ферментов и белков, обеспечивающих изменившиеся ме­таболические потребности клетки, но и распад и удаление тех биомолекул, которые больше не нужны для ее нормального функционирования. В ряде случаев изменение свойств и уровня активности протео­литических ферментов имеет адаптивный характер и может свидетельствовать о приспособлении орга­низма к изменяющимся условиям окружающей среды, в других - о развитии тканевой патологии, обыч­но тесно связанной с нарушением базального уровня внутриклеточного кальция.

Одними из наиболее удобных объектов для изучения влияния ксенобиотиков, в том числе тяже­лых металлов, признаны морские беспозвоночные. В сравнении с позвоночными животными многие виды моллюсков обладают слаборазвитой способностью к биотрансформации ксенобиотиков. Важные характеристики мидий как объектов токсикологических исследований - высокая способность к аккуму­ляции загрязнителей из среды в тканях и сравнительно низкая активность системы цитохрома Р 450 (Fung et al., 2004). В настоящей работе изучали активность внутриклеточных Са²⁺-зависимых протеиназ (кальпаинов) мидий Mytilus edulis L. при воздействии ионов тяжелых металлов в экспериментах in vitro и in vivo. В эксперименте in vitro были протестированы металлы, обладающие, согласно литературным данным, сродством к кальпаинам рыб. В условиях аквариального эксперимента моллюски подвергались воздействию кадмия, способного связываться с SH-группами биомолекул, и меди - эссенциального ме­талла, в высоких концентрациях токсичного для организма (Губанов и др., 2008).

Материалы и методы исследования

Аквариальный эксперимент был выполнен на одноразмерных мидиях Mytilus edulis L., отлов­ленных на сублиторали в губе Чупа Кандалакшского залива Белого моря. После акклимации к лабо­раторным условиям (16-литровые аквариумы с естественным температурным и световым режимом, составом воды и оксигенацией) мидии были разделены на 7 групп, которые подвергали воздейст­вию растворов солей (хлоридов) меди и кадмия (концентрация приведена в пересчете на катион): группа 1 - 5 мкг/л Си2'. группа 2 - 50 мкг/л Си2'. группа 3 - 250 мкг/л Си2'. группа 4 - 10 мкг/л Cd2+, группа 5 - 100 мкг/л Cd2+. группа 6 - 500 мкг/л Cd2+. Контролем служили моллюски. содер­жащиеся в аквариуме без добавления металлов (группа 7). Экспозиция опыта составила 24 и 72 ча­са. Из каждой экспериментальной группы отбирали для дальнейшего анализа по 7 особей. Отпрепа­рированные органы (жабры. гепатопанкреас) хранили при -80 °С до начала анализа.

Активность кальпаинов определяли во фракциях цитоплазматических белков и микрочастиц (мембраносвязанных белков) (Enns. Belcastro. 2006). Методика позволяет тестировать активность кальпаинов без предварительного гель-хроматографического разделения белков. что важно при ра­боте с малым объемом биологического материала.

Образцы тканей (~ 100 мг) гомогенизировали в 10-кратном объеме 20 мМ трис-HCl буфера (рН 7.5) с добавлением 80 мМ КС1. 5 мМ натриевой соли ЭДТА и 20 мМ дитиотреитола (ДТТ). В супернатанте после центрифугирования (20 000 g. 20 мин.) определяли активность кальпаинов (ци­тозольная фракция). Осадок ресуспендировали в 10 объемах того же буфера с добавлением 0.33% тритона X-100. в супернатанте после повторного центрифугирования в тех же условиях также опре­деляли активность кальпаинов (мембраносвязанная фракция фермента). Са²⁺-зависимую протеоли­тическую активность кальпаинов оценивали по гидролизу щелочно-денатурированного казеина. К реакционной смеси (50 мМ трис-HCl буфер (рН 7.5). 1 мг/мл казеина. 20 мМ ДТТ) добавляли 200 мкл одной из фракций (конечный объем 500 мкл) и 5 мМ СаС12 для активации кальпаинов (в кон­троль - 5 мМ ЭДТА). После 30-минутной инкубации при 28 °С отбирали аликвоты 100 мкл. в кото­рых определяли содержание остаточного белка по методу Брэдфорд (Bradford. 1976). Единица ак­тивности кальпаинов определялась как количество фермента. вызывающее увеличение на 0.1 опти­ческого поглощения при 595 нм за 1 час инкубации при 28 °С.

Активность кальпаинов при взаимодействии in vitro с ионами тяжелых металлов определяли после предварительной гель-хроматографии образцов на колонках с сефакрилом S300. уравнове­шенным буфером А (10 тМ трис-HCl (рН 7.5). 4 тМ ЭДТА. 5 тМ 2-меркаптоэтанола. 50 тМ NaCl). Наносили на колонку экстракты мягкого тела мидий. полученные после гомогенизации и центрифугирования (105 000 g. 60 мин) в буфере А. содержащем 0.25 М сахарозы. Элюцию белков проводили со скоростью 24 мл/ч буфером А. Активность Са²⁺-зависимых протеиназ во фракциях элюента (4.0 мл) определяли стандартным методом по гидролизу щелочно-денатурированного ка­зеина (Murachi et al. 1981). Реакционная смесь включала 50 мМ имидазол-HCl буфера (pH 7.5). 0.4% казеина. 5 мМ дитиотреитола. 2.5 мМ CaCl2. в контрольные пробы кальций добавляли после инку­бации. После инкубации (28 °С. 30 мин.) реакцию останавливали добавлением равного количества 10% трихлоруксусной кислоты. Концентрацию кислоторастворимых продуктов определяли при 280 нм. Единица активности кальпаинов определялась как количество фермента. вызывающее увеличе­ние на 1.0 оптического поглощения при 280 нм за 1 час инкубации при 28 °С (Murachi et al. 1981).

Для оценки действия различных катионов на активность кальпаинов в обычной реакционной смеси CaCl₂ заменяли на хлорид исследуемого металла (Ca²⁺. Ba²⁺. Cd2⁺. Cu²⁺. Co²⁺. Zn²⁺. Mg²⁺. Fe³⁺) в конечной концентрации 2.5 мМ (контроль - 2.5 мМ CaCl2). Эффект 2.5 мМ каждого катиона был также определен в присутствии 2.5 мМ CaCl2 (контроль - 5 мМ CaCl2).

Результаты исследований были обработаны статистически при помощи непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни) (Гублер. Генкин. 1969).

Результаты и обсуждение

Активность препарата кальпаинов из мягкого тела мидий была измерена в присутствии ионов различных металлов (Ca²⁺. Ba²⁺. Cd2⁺. Cu²⁺. Co²⁺. Zn²⁺. Mg²⁺. Fe³⁺). Эффект. оказывае­мый различными катионами. варьировал от активации. сродни индуцируемой кальцием. до полного ингибирования. Как показано на рисунке 1. Ca²⁺ в концентрации 2.5 мМ является наиболее эффективным активатором кальпаинов. Фермент также активируется в присутствии 2,5 мМ Ba²⁺ до 70% от уровня активности, индуцированной действием Ca²⁺. Ионы Cu²⁺ и Mg²⁺ также способны активировать фермент, но в значительно меньшей степени. В присутствии 2,5 мМ Cd2⁺, Co²⁺, Zn²⁺ и Fe³⁺ активность фермента не выявлялась. Сочетанное действие Ca²⁺ и Mg²⁺ приводило к сильному ингибированию кальций-индуцируемой активности, Ca²⁺ и Cd2⁺,

Co²+, Zn²+, Fe³+ - к полной инактивации.

Рис. 1. Относительная активность кальпаинов мягкого тела мидии Mytilus edulis L. в присутствии различных катионов

В целом, результаты изучения активности кальпаинов мидий в присутствии различных катио­нов сходны с данными Ladrat et al. (2002), полученными для m-кальпаина из мышц морского окуня. По данным литературы (Ladrat et al., 2002, Gaitanaki et al., 2003), Ba²⁺ и Sr2⁺ способны активировать кальпаины, выделенные из тканей разных организмов. Сходная способность катионов Ca²⁺, Sr2⁺, Ba²⁺ к активации кальпаинов объясняется их структурным родством, на основании которого они объединены в одну группу химических элементов периодической системы. Известно, что повышен­ная способность стронция к аккумуляции в организме обусловлена замещением Ca²⁺ в костной и других тканях. Следствием этого является нарушение обмена Ca²⁺ в организме и нарушение Ca²⁺- зависимых регуляторных процессов, что определяет токсическое действие Sr2⁺. Катионы Cd2⁺, Co²⁺, Zn²⁺ и Fe³⁺ не способны индуцировать активность кальпаинов мидий, также они подавляют кальций-индуцированную активность кальпаинов, по всей видимости, блокируя SH-группу актив­ного центра фермента.

На рисунках 2 и 3 представлены данные по изменению активности внутриклеточных Са²⁺-за- висимых протеиназ в жабрах и гепатопанкреасе мидий при воздействии солей меди и кадмия в экс­перименте in vivo. Активность кальпаинов в органах изменялась в зависимости от концентрации и времени воздействия металла на организм. Так, по истечении первых суток воздействия меди и кад­мия наблюдался более высокий уровень активности кальпаинов в жабрах по сравнению с контро­лем. Можно предположить, что наблюдаемая активация кальпаинов в жабрах мидий при кратком воздействии тяжелых металлов сопутствует развитию неспецифической компенсаторной реакции, направленной на приспособление организма к высоким концентрациям изучаемых поллютантов в среде. После трех суток воздействия меди и кадмия происходило снижение активности Са²⁺-зависи- мых протеиназ в жабрах мидий по сравнению с контролем. Согласно литературным данным (Чело- мин, 1998), в условиях острого эксперимента у мидий наблюдается диспропорция в аккумуляции металлов, в результате которой основная нагрузка ложится на клетки жабр. Вероятно, вследствие этого, суточное воздействие металлов приводит к повышению уровня активности кальпаинов в жабрах мидий, а более длительное (3 суток), предполагающее возможное перераспределение метал­ла в организме, - к снижению.

действии различных концентраций меди (1 - 1 сутки экспозиции, 3 - 3 сутки экспозиции, * - отличие от контроля достоверно при р < 0,05)

Рис. 3. Относительная активность кальпаинов (Е595/г белка/час) в органах мидии Mytilus edulis L. при дейст­вии различных концентраций кадмия (1 - 1 сутки экспозиции, 3 - 3 сутки экспозиции, * - отличие от контро­ля достоверно при р < 0,05)

Наряду с этим было установлено, что в гепатопанкреасе мидий уровень активности кальпаи- нов не изменялся при суточном воздействии меди и кадмия всех изученных концентраций; лишь через трое суток наблюдались достоверные отличия Са²⁺-зависимой активности в данном органе. Вероятно, это можно объяснить тем, что к этому времени может начинаться отток металлов от уяз­вимых тканей (жабры) к тканям, функционально задействованным в детоксикации, аккумуляции и экскреции ксенобиотиков (гепатопанкреас и почки).

Обращает на себя внимание то, что кадмий и медь при трехсуточной экспозиции оказыва­ют противоположное действие на активность кальпаинов в гепатопанкреасе. Подавление актив­ности кальпаинов при действии кадмия, вероятно, можно объяснить его способностью ингиби­ровать биомолекулы за счет специфичного связывания с их реакционными SH-группам. Следо­вательно, можно предположить, что при такой длительности воздействия аккумулированный из среды металл не только проник во внутреннюю среду организма, но и достиг субклеточных структур. Что касается меди, то известна важная роль этого металла в процессах дыхания бес­позвоночных как компонента дыхательного пигмента крови - гемоцианина, при этом медь явля­ется вторым по степени накопления тяжелым металлом в жабрах (Андроников и др., 2002). Можно предположить, что при перераспределении в организме меди, поступившей из среды, большая ее часть задерживается в жабрах, а в гепатопанкреас поступает незначительная доза, способная индуцировать репаративные и экскреторные процессы, о чем можно судить по на­блюдаемой активации кальпаинов после трехсуточного воздействии меди в самой высокой из изученных концентраций (250 мкг/л).

Заключение

В экспериментах in vitro и in vivo было протестировано действие катионов двух- и трехва­лентных металлов на активность протеиназ семейства кальпаинов из тканей мидий. Полученные данные свидетельствуют о том, что механизм специфичного взаимодействия тяжелых металлов с изучаемыми цистеиновыми протеиназами может реализовываться как за счет блокирования SH- групп их активного центра, так и за счет замещения их активатора (кальция) на кальций-зависимых этапах функционирования кальпаинов. Обнаружено инактивирующее действие катионов кадмия, кобальта, цинка и железа (III) на частично очищенный кальпаин мидий, однако, некоторые металлы (барий), аналогично кальцию, способны активировать кальпаины.

Установлено, что при опосредованном влиянии ионов меди и кадмия, растворенных в среде, на кальпаины в органах мидий, их активность зависит от концентрации металла, времени воздейст­вия и природы действующего металла, определяющей специфичность его действия, динамику акку­муляции и перераспределения в организме.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-01140-а, Программы Президента РФ «Веду­щие научные школы» НШ-306.2008.4 и проекта Программы Президиума РАН «Биологическое разнообразие».

Литература

Андроников В. Б., Коротнева Н. В., Пашкова И. М., 2002. Содержание тяжелых металлов в различных тканях кальмара Illex illecebrosus // Экологическая химия. № 11(1). С. 40-44.

Губанов В. И., Болтачев А. Р., Копытов Ю. П., 2008. Состояние загрязнения донных отложений Феодо­сийского залива нефтяными углеводородами и тяжелыми металлами // Экология моря. Вып. 75. С. 89-93.

Гублер Е. В., Генкин А. А., 1969 Применение критериев непараметрической статистики для оценки различий двух групп наблюдений в медико-биологических исследованиях. М.: Медицина, 1969. 125 с.

Челомин В. П., Бельчева Н. Н., Захарцев М. В., 1998. Биохимические адаптации мидии Mytilus trossulus к ионам кадмия и меди // Биология моря. Т . 24. № 5. С . 319-325.

Bradford M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. № 72. P. 248-254.

Enns D. L., Belcastro A. N., 2006. Early activation and redistribution of calpain activity in skeletal muscle during hindlimb unweighting and reweighting // Can. J. Physiol. Pharmacol. № 84. P. 601-609.

Gaitanaki C., Papazafiri P., Beis I., 2003. The calpain-calpastatin system and the calcium paradox in the isolated perfused pigeon heart // Cell Physiol Biochem. №. 13(3). Р. 173-180.

Ladrat C., Verrez-Bagnis V., Noel J., Fleurence J., 2000. Milli-calpain from sea bass (Dicentrarchus labrax) white muscle: purification, characterization of its activity and activation in vitro // Comp. Biochem. Physiol. Vol. 125. № 1. P. 83-95.

Murachi T., Hatanaka M., Yasumoto Y., Tanaka K., 1981. A quantitative distribution study on calpain and calpastatin in rat tissues and cells // Biochem. Int. Vol. 2 (6). P. 651-656.

Fung C. N., Lam J. C. W., Zheng G. J., Connell D. W., Monirith I., Tanabe S., Richardson B. J., Lam P. K. S., 2004. Mussel-based monitoring of trace metal and organic contaminants along the east coast of China using Perna viridis and Mytilus edulis // Environ. Poll. Vol. 127. Р. 203-216.

THE EFFECT OF HEAVY METAL IONS ON INTRACELLULAR Ca2+-DEPENDENT PROTEINASES IN MYTILUS EDULIS L. IN THE EXPERIMENTS IN VITRO AND IN VIVO

N. P. Kantserova, L. A. Lysenko, N. N. Nemova, V. V. Ostashkova

¹ Institute of Biology Karelian Research Centre RAS, Petrozavodsk, Russia ² Petrozavodsk State University, Petrozavodsk e-mail: nkantserova@yandex.ru

The effect of heavy metal ions on intracellular Ca2⁺-dependent proteinases (calpains) of mussels, Mytilus edulis L., has been investigated in vitro and in vivo. Mechanism of action of heavy metal ions with calpain can be realized by binding with SH-group of the enzyme or by replacement of Ca2⁺ in Ca2⁺- dependent processes. Some heavy metal ions (Cd2⁺, Co2⁺, Zn2⁺, Fe3⁺) has been found to be ineffective for the activation of mussel calpain in vitro, while Ba2⁺ has been found to be able to activate the enzyme. In aquaria experiment was shown that the effect of Cu2⁺ and Cd2⁺ on calpain activity depends on concentration of ion, time of action and metal properties defining its specificity and the accumulation and redistribution dynamics in the organs.