ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ СОДЕРЖАНИЯ БТШ70 В КЛЕТКАХ ПРЕСНОВОДНЫХ И ЭВРИГАЛИННЫХ ИНФУЗОРИЙ И АМЕБ ПРИ ИХ АДАПТАЦИИ К ИЗМЕНЕНИЮ СОЛЕНОСТИ СРЕДЫ

А. В. Гудков¹, А. О. Смуров^{2, 3}, Ю. И. Подлипаева¹

¹ Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН, г. Санкт-Петербург, Россия

² Учреждение Российской академии наук Зоологический институт РАН, г.

³ Биолого-почвенный факультет С.-Петербургского государственного университета

e-mail: pelgood@rambler.ru Введение

Известно, что клетки всех живых организмов в ответ на действие стрессовых факторов реаги­руют синтезом так называемых белков теплового шока (БТШ) (Feder, Hofmann, 1999). Эти белки способствуют адаптации организмов и их клеток к неблагоприятным воздействиям. Наиболее изу­ченными являются БТШ с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70), обладающие весьма низкой ви­доспецифичностью (Маргулис, Гужова, 2000, 2009).

Одним из современных направлений в исследовании БТШ является изучение их роли в про­цессе приспособления организмов к влиянию естественных и антропогенных факторов среды с це­лью понять механизмы, лежащие в основе адаптации живых систем к стрессовым воздействиям (Feder, Hofmann, 1999; Евгеньев и др., 2005; Garbuz et al., 2008). В большинстве этих работ в качест­ве стрессового воздействия используется температура, а объектами исследований служат либо мно­гоклеточные животные, либо прокариотные микроорганизмы. Значительно меньше внимания уде­ляется БТШ свободноживущих одноклеточных организмов. В подавляющем большинстве случаев функции БТШ70 у простейших изучаются в связи с их адаптацией к изменениям температуры окру­жающей среды (McMullin, Hallberg, 1987; Kalinina et al, 1988; Joshi et al., 1992; Requena et al., 1992; Wallace et al., 1992; Field et al., 2000; Perez-Serrano et al., 2000; и др.). Однако логично предполагать также участие БТШ70 и в адаптации клеток к изменению солености водной среды, в которой они обитают, так как соленость, наряду с температурой, является одним из двух главных факторов эво­люции гидробионтов.

Целью настоящего исследования было изучение особенностей динамики содержания БТШ70 в ответ на изменение солености среды у представителей далеко отстоящих друг от друга в эволюци­онном отношении таксонов низших эукариот: инфузорий и амеб.

Для исследования реакции шаперонной системы были выбраны виды, относящиеся к разным экологическим группам, различающимся по способности организмов адаптироваться к изменению солености среды (см: Smurov, Fokin, 2001): Amoeba proteus (группа стенопресноводных видов, спо­собных существовать при соленостях среды до 2.5-3.5 %о), Paramecium jenningsi (группа эупресно- водных видов, способных существовать при соленостях среды до 6-8 %), и Paramecium nephridia- tum (группа эвригалинных организмов, способных существовать как в пресной, так и в полносоле­ной морской воде 35 %).

Материал и методы

В работе использованы свободноживущие лобозные амебы Amoeba proteus (штамм Val) из коллекции Лаборатории цитологии одноклеточных организмов Института цитологии РАН, инфузо­рии Paramecium jenningsi (штамм SR1-10) и P. nephridiatum (штамм SR98-1) из коллекции культур Лаборатории зоологии беспозвоночных БиНИИ СПбГУ. Культивирование простейших осуществля­ли по стандартным методикам: инфузорий - на салатной среде, инокулированной Klebsiella aerogenes (Sonneborn, 1970), амеб - на модифицированном минеральном растворе Прескотта и Кэр­риера (Prescott, Carrier, 1964); кормление амеб осуществляли инфузориями Tetrahymena pyriformis (штамм GL).

Для проведения соленостного шока клетки P. jenningsi и A. proteus, выращенные в пресной среде (0 %), помещали на 2 часа в среду соленостью 2 %. Культуры, акклимированные к среде со­леностью 2 %, помещали в пресную воду и также выдерживали в ней в течение 2 часов. В качестве контроля использовали простейших, культивируемых в средах с исходными для них значениями солености, равные по плотности опытным культурам.

Проведение соленостного шока инфузорий P. nephridiatum осуществляли по аналогичной схе­ме: клетки, акклимированные к пресной среде (0 %), помещали на 1 ч в воду с соленостью 10 %, а клетки, акклимированные к солености 10 %, помещали на 1 ч в пресную воду (0 %) и затем в обоих случаях инфузорий возвращали в среду с первоначальной соленостью.

В качестве дополнительного контроля для подтверждения принадлежности выявляемых по­сле соленостных шоков полипептидов к БТШ70, клетки P. jenningsi, P. nephridiatum и A. proteus, выращенных как в пресной, так и в соленой среде, подвергали тепловому шоку (37 °С, 1 ч).

Подготовку образцов клеток протистов к проведению SDS-электрофореза производили в со­ответствии с описанными нами ранее методами (Podlipaeva, 2001). Сразу после окончания электро­фореза проводили электроблотинг (Towbin et al., 1979) при напряжении 60 V. Белок теплового шока выявляли после обработки нитроцеллюлозы моноклональными антителами SPA 822 против БТШ70 (Stressgen technologies, Canada), специфичными как к конститутивной, так и к индуцибельной фор­ме белка теплового шока семейства 70 кДа. Зоны связывания белков с анти-ЖР70 антителами ок­рашивались на нитроцеллюлозе при помощи вторичных биотинированных антител, конъюгирован­ных со щелочной фосфатазой (Sigma Chemical Company) в результате проведения ферментативной реакции. Для определения молекулярной массы выявляемых полипептидов использовали маркеры молекулярной массы (14-220 кДа) High Range Rainbow Molecular Weight Markers (Amersham Biosci­ences, England) и бычий сывороточный альбумин (молекулярная масса - 66 кДа).

Результаты и обсуждение

Методом иммуноблотинга в тотальном белковом экстракте амеб A. proteus выявляется поли­пептидный антиген с молекулярной массой около 84 кДа, перекрестно реагирующий с антителами к БТШ70 крупного рогатого скота (рис. 1). В тотальном белковом экстракте инфузории P. jenningsi выявляется полипептидный антиген с той же молекулярной массой, что и у A. proteus, который так-

Рис. 1.. БТШ70 в клетках амеб Amoeba proteus штамма Val, культивируемых в среде с разной соленостью,

подвергнутых соленостному и тепловому шокам.

а - маркеры молекулярной массы; б - контрольная культура амеб, 0 %%; в - амебы из пресной среды, подвергнутые тепло­вому шоку (37 °С, 1 ч), через 3 ч после воздействия; г - амебы из пресной среды, подвергнутые соленостному шоку (2 %, 2 ч), через 3 ч после воздействия; д - культура амеб, акклимированных к 2 %, не подвергавшаяся шоковым воздействиям; е - культура амеб, акклимированных к 2 % , подвергнутая тепловому шоку (37 °С, 1 ч), сразу после воздействия; ж - культура амеб, акклимированных к 2 %, подвергнутая тепловому шоку (37 °С, 1 ч), через 3 ч после воздействия; з - куль­тура амеб, акклимированных к 2 %, подвергнутая соленостному шоку (0 %, 2 ч), через 3 ч после воздействия.

При повышении солености среды от 0 до 2 %о концентрация обнаруженного нами антигена в клетках амеб спустя 3 ч поле воздействия заметно возрастала (рис. 1, г). Амебы, акклимированные к со­лености 2 %о, демонстрируют высокий конститутивный уровень обнаруженного нами антигена, боль­ший, чем у клеток, адаптированных к пресной среде (рис. 1, б, д). Повышенное содержание БТШ в соле­ности, близкой к границе толерантного диапазона данного штамма (2.5 %о), подтверждает повреждаю­щий характер этих условий среды. При дополнительном стрессовом воздействии - перенос клеток, акк- лимированных к этой солености, в пресную среду, а также тепловой шок, - уровень БТШ70 снижается.

Аналогичная картина была нами выявлена у инфузорий P. jenningsi. Методом дотблотинга было показано, что уровень БТШ70 незначителен в клетках, выращенных в пресной среде (рис. 2, a), и повышается при соленостном шоке (рис. 2, в). Напротив, инфузории, акклимированные к соле­ности 2 %о, демонстрируют высокий конститутивный уровень БТШ70 (рис. 2, б), который снижает­ся при стрессовом воздействии (соленостном шоке) (рис. 2, г).

Рис. 2. БТШ70 в клетках инфузорий Parame­cium jenningsi штамма SR1, культивируемых в среде с разной соленостью и подвергнутых со- леностным шокам. Иммунохимическая окра­ска дот-блотов тотального белкового экстракта инфузорий.

а - контрольная культура инфузорий, 0 %о; 6 - куль­тура инфузорий, акклимированных к 2 %о; в - солено- стный шок 0 2 %о; г - соленостный шок 2^ 0 %о.

Методом иммуноблотинга в тотальном белковом экстракте инфузорий P. nephridiatum выяв­ляется полипептидный антиген с молекулярной массой около 70 кДа - как у интактных (контроль­ных) клеток после их длительной акклимации к пресной или соленой среде, так и у клеток, подверг­нутых соленостному и тепловому шоку (рис. 3). Кроме того, в клетках P. nephridiatum, акклимиро- ванных к солености 10 %о, обнаруживается дополнительный полипептид с молекулярной массой около 60 кДа, который также перекрестно реагирует с антителами против БТШ70 (рис. 3, в).

Уровень белка 70 кДа после переноса из среды соленостью 10 % в пресную воду (10 0%%)

превышает таковой в контроле (рис. 3, в, г), тогда как зона окрашивания БТШ70 у клеток после пе­реноса из пресной воды в соленую (0 10%) выражена слабо и концентрация белка заметно мень­

ше, чем в контроле (рис. 3, б, д).

Рис. 3. БТШ70 в клетках инфузорий Paramecium nephridiatum в нормальных условиях и после стрессового воздействия. Иммуноблотинг после электрофореза в 13%- ном ПААГ.

а - маркеры молекулярной массы; б - интактные инфузории, акклимированные к пресной среде (соленость 0 %); в - интакт­ные инфузории, акклимированные к среде соленостью 10 %; г - клетки, акклимированные к среде соленостью 10 %, через 2 ч после соленостного шока при (0 %) в течение 1 ч; д - клетки, акклимированные к пресной среде (0 %), через 2 ч после прове­дения соленостного шока при 10 % в течение 1 ч.

Можно видеть, что соленостный шок вызывает у инфузорий, акклимированных к пресной и соленой средам, несимметричный ответ в отношении расхода - синтеза БТШ70, т. е. в случае пере­носа клеток из среды с соленостью 10 % в пресную воду концентрация БТШ70 в клетках значи­тельно выше, чем через такое же время после переноса из пресной воды в соленую.

Таким образом, согласно полученным результатам, у эвригалинных, стенопресноводных и эупресноводных видов протистов наблюдаются различные стратегии ответа шаперонной системы на повышение и понижение солености среды. Результатом акклимации эупресноводной P. jenningsi к повышенной солености является повышение конститутивного уровня содержания БТШ70 в клет­ке, тогда как для эвригалинного вида P. nephridiatum уровень содержания БТШ70 в клетке не изме­няется. Стенопресноводный вид A. proteus имеет сходную с эупресноводным видом реакцию шапе­ронной системы на изменение солености среды.

В случае понижения солености среды эвригалинные организмы увеличивают уровень БТШ70 в клетке: у эвригалинных инфузорий P. nephridiatum, акклимированных к пресным условиям (0 % ), уровень БТШ70 заметно превышал таковой у инфузорий, акклимированных к соленой среде (10 %). Полученные данные указывают на то, что для эвригалинных парамеций длительная акклимация к пресной воде является более сильным стрессом, нежели акклимация к среде соленостью 10 %.

Сравнение конститутивных уровней БТШ70 в клетках двух резко различных в отношении соле­устойчивости (т. е. способности выживать при разной солености среды) видов инфузорий - пресно­водной P. jenningsi и эвригалинной P. nephridiatum -показало, что у последних, акклимированных к пресной среде, этот уровень выше, чем у первых, также акклимированных к пресной воде. Т. е. у эв- ригалинной инфузории акклимация к пресной воде индуцирует синтез БТШ70 и поддержание его уровня в большей степени, чем у сугубо пресноводного представителя того же рода в тех же услови­ях. Таким образом, в процессе акклимации такие инфузории оказываются в определенном смысле преадаптированными к резким изменениям солености окружающей среды и реагируют на них, ис­пользуя уже накопленный в клетке пул белков теплового шока. Это выражается, в частности, в замет­ном понижении исходно высокого уровня БТШ70 у эвригалинных парамеций, акклимированных к пресной среде, после их переноса в 10 %.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 08­04-01003).

Литература

Евгеньев М. Б., Гарбуз Д. Г., Зацепина О. Г. 2005. Белки теплового шока: функции и роль в адаптации к гипертермии // Онтогенез. Т. 36. С. 265-273.

Маргулис Б. А., Гужова И. В. 2000. Белки стресса в эукариотических клетках // Цитология. Т. 42, № 4.

С. 323-342.

Маргулис Б. А., Гужова И. В. 2009. Двойная роль шаперонов в ответе клетки и всего организма на стресс // Цитология. Т. 51, № 3. С. 219-228.

Feder M. E., Hofmann G. E. 1999. Heat-shock proteins molecular chaperones, and the stress response:

evolutionary and ecological physiology // Ann. Rev. Physiol., V. 61. P. 243-282.

Field J., Van Dellen K., Ghosh S. K., Samuelson J. 2000. Responses of Entamoeba invadens to heat shock and encystation are related // J. Eukar. Microbiol. V. 47. P. 511-514.

Garbuz D. G., Zatsepina O. G., Przhiboro A. A., Yushenova I., Guzhova, I. V., Evgen'ev M. B. 2008. Larvae of related Diptera species from thermally contrasting habitats exhibit continuous up-regulation of heat shock proteins and high thermotolerance // Molecular Ecology. V. 17. P. 4763-4777.

Joshi B., Biswas S., Sharma Y. D. 1992. Effect of heat-shock on Plasmodium falciparum viability, growth and expression of the heat-shock protein 'PFHSP70-I' gene // FEBS Lett. V. 312. P. 91-94.

Kalinina L. V., Khrebtukova I. A., Podgornaya O. L., Wasik A., Sikora J. 1988. Heat shock proteins in Amoeba // Eur. J. Protistol. V. 24. P. 64-68.

Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. V. 227. P. 680-685.

McMullin Th. W., Hallberg R. L. 1987. A normal mitochondrial protein is selectively synthesized and accumulated during heat shock in Tetrahymena thermophila // Mol. Cell Biol. V. 7. P. 4414-4423.

Perez-Serrano J., Martinez J., Perez B., Bernadina W. E., Rodriguez-Caabeiro F. 2000. In vitro shock response to different stressors in free living and pathogenic Acanthamoeba // Int. J. Parasitol. V. 30. P. 829-835.

Podlipaeva Y. I. 2001. Heat shock protein of 70 kDa in Amoeba proteus // Protistology. V. 2. P. 123-129.

Prescott D. M., Carrier R. F. 1964. Experimental procedures and cultural methods for Euplotes eurystomus and Amoeba proteus / Ed. D. M. Prescott. Methods in cell physiology New York - London: Acad. Press. P. 85-95.

Requena J. M., Jimee-Ruiz H., Soto M., Assiego R., Santaren J. F., Lopez., Pataroyo E., Alonso C. 1992. Regulation of HSP70 expression in Trypanosoma cruzi by temperature and groing phase // Mol. Biochem. Parasitol.

V. 53. P. 201-211.

Smurov A. O., Fokin S. I. 2001. Use of salinity tolerance data for investigation of phylogeny of Paramecium (Ciliophora, Peniculia) // Protistology. V. 2. P. 130-138.

Sonneborn T. M. 1970. Methods in Paramecium research // Meth. Cell Physiol. V. 4. P. 241-339.

Towbin H., Staeheln T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. V. 76 . P. 4350-4354.

Wallace G. R., Ball A.E., MacFarlane J., el Safi S. H., Miles M., Kelly J. M. 1992. Mapping of visceral leishmaniasis-specific immunodominant B-cell epitope of Leishmania donovani Hsp70 // Infection and Immunity. V. 60. P. 2688-3693.

ALTERATIONS OF HSP70 CONTENT IN THE CELLS OF FRESHWATER AND EURYHALINE CILIATES AND AMOEBAE IN THE COURSE OF THEIR ADAPTATION TO ENVIRONMENTAL SALINITY CHANGES

A. V. Goodkov¹, A. O. Smurov^{2, 3}, Ju. I. Podlipaeva¹

¹ Institute of Cytology RAS, St. Petersburg, Russia ² Zoological Institute RAS, St. Petersburg ³ Biological faculty of St.-Petersburg State University e-mail: pelgood@rambler.ru

The peculiarities of chaperone system reaction, including dynamics of HSP70 content as a result of environment salinity changes were studied in the representatives of long-distant taxa of lower eukaryotes, namely amoebae and ciliates. Species under study do belong to different

ecological groups - Amoeba proteus (steno-freshwater species, salinity range 2.5-3.5 %o), Paramecium jenningsi (eufreshwater species, 6-8 %o) and Paramecium nephridiatum (euryhaline organisms, inhabiting fresh- and marine water up to 35 %o).

Different strategies of chaperone system response were observed depending on increase or decrease of salinity of the medium. Acclimation of eufreshwater P. jenningsi to higher salinity resulted in increase of constitutive HSP70 level in the ciliate cells, whereas in the cells of euryhaline P. jenningsi the HSP70 level in these experimental conditions did not change. Steno- freshwater A. proteus reacts in the manner similar to eufreshwater ciliates. In the course of acclimation the euryhaline ciliates appear to be more preadapted to drastic environmental salinity changes than freshwater representatives of the same genus and respond to such changes by expenditure of heat shock protein pool, accumulated in their cells.