ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА-СТРИГУНА CHIONOECETES OPILIO В ПОЛУЧЕНИИ БЕЛКОВЫХ ГИДРОЛИЗАТОВ ИЗ ОТХОДОВ ПЕРЕРАБОТКИ ТРЕСКИ

И.И. Лыжов¹, К.С. Рысакова¹, В.А. Мухин¹, В.Ю. Новиков¹, А.Ю. Широнина^{2 1}Полярный научно-исследовательский институт морского рыбного хозяйства и океанографии им.

e-mail: lyzhov@pinro.ru

Введение

В настоящее время в Баренцевом море наблюдается рост численности и расширение ареала обитания краба-стригуна Chionoecetes opilio. Ожидается, что в ближайшие годы произойдет значи­тельное увеличение численности краба, в первую очередь в восточной части Баренцева моря, что позволяет считать вселенца перспективным для промысла. В связи с этим возникает необходимость разработки способов его рационального использования с точки зрения технологии.

Одним из наиболее перспективных направлений утилизации неиспользуемого белка является полу­чение из него белковых гидролизатов, которые могут применяться в качестве питательной основы для микробиологических диагностических сред, кормовых компонентов для рыб, птицы и сельскохозяйствен­ных животных, питательных растворов для послеоперационных больных и т. д. (Мухин, 2001). Кроме это­го, белок может использоваться не только в качестве субстрата для ферментолиза, но и в качестве источ­ника протеолитических, хитинолитических, липолитических и иных ферментов. Применение гепатопан- креаса краба-стригуна представляется наиболее перспективным именно в этом качестве.

Гидролиз белков может быть осуществлен двумя способами: химическим (под действием кислот и щелочей) или биологическим (под действием протеолитических ферментов) (Технология рыбы..., 2006).

По составу гидролизаты представляют собой смесь аминокислот и низкомолекулярных полипептидов, которые легче усваиваются животными, чем белки кормовой муки. Кроме того, обработанные соответствую­щим образом белковые гидролизаты используются в медицинской практике, где они могут служить в качестве составляющих частей диет.

Гидролиз белков под действием кислоты называется кислотным гидролизом, а полученный про­дукт - кислотным гидролизатом. Кислотный гидролиз является достаточно технологичным и не содержит опасности бактериального загрязнения окружающей среды. Однако этот способ имеет недостаток - в ходе гидролиза происходит частичное разрушение ряда аминокислот (триптофан, цистин, метионин и др.).

При щелочном способе получения белковых гидролизатов наблюдается рацемизация амино­кислот (часть α-аминокислот превращается в D-аминокислоты) и почти полное разрушение цистеи­на, цистина и аргинина. Поэтому этот способ практического применения не нашел.

Способ расщепления белка под действием протеолитических ферментов называется фермен­тативным гидролизом. В этом случае для расщепления белков к субстрату добавляют измельчен­ные пищеварительные органы рыб или теплокровных животных, содержащие протеолитические ферменты, или чистые ферментные препараты.

Процесс ферментативного гидролиза протекает при невысокой температуре (не выше 50 °С), что спо­собствует сохранению в готовом продукте (гидролизате) биологически активных веществ и в отличие от гидролизата, полученного химическим способом, в нем присутствуют те же аминокислоты и в том же соот­ношении, что и исходное сырье. Кроме того, ферментативный гидролиз разрушает связь белков с липидами, что позволяет легко отделить липиды от исходного сырья и делает гидролизат стойким при хранении.

Целью наших исследований являлось определение возможности использования гепатопан- креаса краба-стригуна в качестве альтернативного источника для получения ферментного препара­та, а также исследование фракционного состава белковых гидролизатов. Данное направление явля­ется весьма актуальным в связи с возможностью получения гидролизатов с заданными свойствами и рациональной переработкой отходов рыбного промысла.

Материалы и методы

Получение белковых гидролизатов осуществляли путем гидролиза фарша, полученного из ос­татков филетировочного производства. Гидролиз проводили ферментными препаратами (ФП), по­лученными по технологии получения ацетонового порошка (Сахаров, 1988). Данный метод заклю­чается в обезжиривании и промывке белков гепатопанкреаса камчатского краба и краба-стригуна органическими растворителями - ацетоном и бутанолом. Полученный препарат затем сушится под вакуумом и представляет собой сухой порошок, который может долгое время храниться. Для полу­чения ферментных препаратов использовали гепатопанкреасы камчатского краба и краба-стригуна.

Образцы ткани (0,75 г) гомогенизировали в 5 мл дистиллированной воды, центрифугировали (75600 g) и фильтровали через нейлоновые фильтры (акродиски) с размером пор 0,45 мкм.

Гидролиз проводили в водяном термостате при температуре 50 °С, затем надосадочную жидкость отделяли центрифугированием при 75600 g и фильтровали через акродиски с размером пор 0,45 мкм.

Затем 100 мкл фильтрата смешивали со 100 мкл буфера для проб и выдерживали на водяной бане при 95 °С в течение 3 мин. Полученные пробы наносили на гелевую пластинку с концентраци­ей акриламида 15 % (Остерман, 1981).

Электорфорез осуществлялся при следующих условиях: предэлектрофорез - последовательное по­вышение напряжение от 100 до 500 V, мощность 15W, сила тока 25 мА; собственно электрофорез - 600 V, 30 W, 50 мА, t 15°С. В качестве маркеров использовали стандарнтные белки фиры Fermentas (Канада) с известной молекулярной массой. Пластины окрашивали по Кумасси (Westermeier, 1993).

Полученные электрофореграммы обрабатывали на двухволновом сканере Shimadzu CS-9000 (длина волны 575 нм) с целью точного определения локализации белковых фракций и интенсивности пятен (бэндов).

Протеолитическую активность оценивали методом Ансона по гидролизу 1%-ного раствора казеината натрия (Алексеенко, 1968).

Результаты и обсуждение

В ходе исследований проведен гидролиз остатков филетировочного производства ФП, полу­ченными из гепатопанкреасов камчатского краба и краба-стригуна.

Из данных, представленных на рисунке 1 а, б, видно, что в процессе электрофореза произош­ло разделение компонентов смеси белковых веществ, содержащихся в образцах, по молекулярно­массовым (ММ) фракциям. В гидролизате, полученном при использовании ФП из гепатопанкреаса камчатского краба обнаружены 3 фракции с ММ: 1 - 14,6 кД; 2 - 24 кД 3 - 37,1 кД. После проведе­ния гидролиза ФП из гепатопанкреаса краба-стригуна, полученный образец разделился на 4 фрак­ции с ММ: 1 - 19,8 кД, 2 - 13,8 кД, 3 - 9,7 кД и 4 - 9,3 кД. Денситометрическим способом определе­но относительное содержание фракций в пробе. В первом случае в гидролизате преобладает фрак­ция 3 (77,7 %), во втором - фракции 2 (39,8 %) и 4 (39,1 %).

В состав тресковых гидролизатов входят белковые фракции, ММ которых меньше 37 кД ( а ), и меньше 19 кД (б), тогда как негидролизованное сырье представляет собой смесь высокомолекуляр­ных белковых фракций, ММ которых лежит в интервале от 16-72 кД и выше (в).

Рис. 1. Электрофореграмма исследуемых веществ:

а - гидролизат трески ферментным препаратом из гепатопанкреаса краба-стригуна; б- гидролизат трески ферментным препаратом из гепатопанкреаса камчатского краба; в- треска фарш

При сравнении значений протеолитической активности ферментных препаратов из гепато- панкреаса камчатского краба и краба-стригуна, не обнаружено принципиальных различий в их ак­тивности. Так, протеолитическая активность ФП камчатского краба соответствует 94,86 мкмоль Tyr/г, а краба стригуна - 94,06 мкмоль Tyr/г.

Однако существенным минусом использования для этой цели краба-стригуна является его ма­лый размер, в силу чего, масса его гепатопанкреаса значительно уступает таковой камчатского краба.

Выводы

В лабораторных условиях получен образец гидролизата из отходов переработки трески с при­менением ФП из гепатопанкреаса камчатского краба и краба-стригуна.

Методом электрофореза определен молекулярно-массовый состав гидролизатов, полученных с примене­нием ферментов из гепатопанкреасов крабов. Установлены ММ фракций, полученных с применением ФП из гепатопанкреаса краба-стригуна, они составляют 9,3 - 19,8 кД. Наличие низкомолекулярных фракций может свидетельствовать об эффективности применения данного ФП для гидролиза белков, содержащихся в сырье.

Установлено процентное соотношение преобладающих фракций в гидролизатах. Их молеку­лярная масса лежит в пределах 9,3 - 37,1 кД.

Обнаружено, что протеолитическая активность ФП из обоих видов крабов практически одинакова.

Таким образом, возможно использование краба-стригуна как альтернативы камчатского краба при получении ФП из гепатопанкреаса.

Литература

Алексеенко, Л. П. Определение активности протеиназ по расщеплению белковых субстратов // Совре­менные методы в биохимии. Т. 2. - М.: Медицина, 1968. - 112 c.

Мухин, В. А. Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидробионтов : получение, свой­ства и практическое использование / В. А. Мухин, В. Ю. Новиков. - Мурманск : Изд-во ПИНРО, 2001. - 97 с.

Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифу­гирование. М., 1981.

Сахаров, И. Ю. Очистка и характеристика коллагенолитической протеазы из гепатопанреаса Paralithodes camtschatica / И. Ю. Сахаров, Ф. Е. Литвин, А. А. Артюков, Н. Н. Кофанова // Биохимия, 1988. - Т. 53, № 11. - С. 1844-1849.

Состояние биологических сырьевых ресурсов Баренцева моря и Северной Атлантики в 2009 г. - Мур­манск: Изд-во ПИНРО, 2009. - 111 с.

Технология рыбы и рыбных продуктов: учебник для ВУЗов / В. В. Баранов, И. Э. Бражная, В. А. Гро­ховский и др.; Под ред. А. М. Ершова. - СПб.: ГИОРД, 2006. - 944 с.

Westermeier R. Electrophoresis in Practice. New York, 1993.

APPLYING OF SNOW CRAB'S HEPATOPANCREAS FOR OBTAINING OF PROTEIN HYDROLYSATES FROM COD FILLETING WASTES

I. I. Lyzhov¹, K.S. Rysakova¹, V.A.

¹ Murmansk, Polar Research Institute of Marine Fisheries and Oceanography (PINRO)

² Murmansk State Technical University (MSTU), Russia e-mail: lyzhov@pinro.ru

Snow crab (Chionoecetes opilio) is a perspective object for further exploration and it may find a use in food and medical industries. The most perspective direction of processing of unused proteins is obtaining of protein hydrolysates. Hydrolysates may be used in microbiological substrates, fodder, nutritious solutions for postoperative patients.

Receiving of hydrolysate was realized by fermentolisys with an enzymatic medication from hepatopancreas of snow crab. Medication was received by application of «acetone powder» technology. As a substrate it was used cod filleting wastes. After that, obtained hydrolysate was investigated by gel filtration and electrophoresis and thus molecular masses of protein fractions were determined. Besides, the proteolytic activity was researched and compared with activity of red king crab.

Following conclusions were received: in first, proteolytic activity of enzymatic medication of snow crab is virtually the same as activity king crab's one, and in second, the enzymatic medical of snow crab can be used as a medication for hydrolysates' preparation.