ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПЕЧЕНИ И ЖАБР ЛЕЩА (ABRAMIS BRAMA L.) ИЗ РЫБИНСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА В КАЧЕСТВЕ БИОИНДИКАТОРА ЗАГРЯЗНЕНИЯ СРЕДЫ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫМИ БИФЕНИЛАМИ

А.А. Морозов¹, Г.М. Чуйко¹, Е.С. Бродский^{2 1}Учреждение Российской академии наук Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН, пос.

²Учреждение Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А. Н. Северцова РАН, г. Москва

e-mail: morozov@ibiw.yaroslavl.ru

Введение

Одной из приоритетных групп загрязнителей водной среды являются полихлорированные бифе­нилы (ПХБ). Они способны аккумулироваться в тканях рыб, находиться в них длительное время и изме­нять ход важнейших процессов жизнедеятельности. В то же время, рыба, являясь одним из последних звеньев в пищевых цепях водных биоценозов, обладает способностью концентрировать многие токси­ческие метаболиты, представляет собой угрозу здоровью человека при ее потреблении в пищу.

При мониторинге водных экосистем необходим индивидуальный анализ химических компо­нентов не только в окружающей среде, но также в тканях животных и растений. Это объясняет воз­растающий интерес к изучению реакции обитателей экосистем на антропогенное воздействие. Ин­тегральная оценка здоровья рыб может служить обобщенным показателем состояния всего водного сообщества, в том числе экологического благополучия или неблагополучия водоема. При этом не­обходимо проводить исследования на различных уровнях организации живых систем. Изменения на молекулярном и мембранном уровнях могут служить сигналом к далеко идущим последствиям для данного вида организмов задолго до того, как наступят необратимые изменения в численности, биологической продуктивности, ареале распространения вида и т.п.

За последние десятилетия накопился обширный материал о реакции рыб на химическое за­грязнение. Растущий уровень антропогенного воздействия на природные популяции рыб остро ста­вит проблему их адаптивных возможностей.

Руднева, 2003; Di Giulio et al, 1995; Moller et al, 1996].

Рыбинское водохранилище - одно из крупнейших в Волжской системе водохранилищ. Ранее была показана пространственная неравномерность загрязнения экосистемы водохранилища вещест­вами антропогенного происхождения, в том числе и ПХБ. Было установлено, что основным локаль­ным источником химического загрязнения водохранилища является Череповецкий индустриальный комплекс. Наиболее загрязненным районом водохранилища является участок Шекснинского плеса от г. Череповца и на протяжении 40-50 км ниже его по течению вдоль бывшего русла р. Шексны. Наиболее чистый район - Моложский плес [Козловская и др., 1997; Флеров и др., 2000; Чуйко и др., 2008]. В связи с этим возникает необходимость сравнительной оценки состояния здоровья рыб, из районов водохранилища, с различной степенью загрязненности.

Цель работы - сопоставить величины показателей АО системы и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в печени и жабрах леща из Рыбинского водохранилища с уровнем накопления общего ко­личества ПХБ, а также отдельных групп конгенеров, в печени леща для оценки состояния здоровья рыб.

Материалы и методы

Объектом исследования служил лещ Abramis brama L. обоего пола, со средними значениями длины и массы тела 35 см и 809 г соответственно. Вылов производился траловым методом в конце июля 2008 г. на 2-х станциях Рыбинского водохранилища: Любец и Первомайка (рис.). После отлова и проведения био-

Расположение станций отбора проб

Определение качественного состава и содержания ПХБ в рыбе проводилось в Лаборатории аналитической экотоксикологии ИПЭЭ РАН методом хромато-масс-спектрометрии высокого разре­шения в собственной модификации [Шелепчиков и др., 2008].

Исследования по определению содержания и активности продуктов ПОЛ и компонентов АО системы проводились в Лаборатории физиологии и токсикологии водных животных ИБВВ РАН. Перед анализом печень и жабры промывали холодным 0,1 М фосфатным буфером с pH 7,5. Затем гомогенизировали тефлоновым пестиком в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с элек­троприводом. В цельном гомогенате определяли: содержание малонового диальдегида (МДА) [Вла­димиров и др., 1972], восстановленного глутатиона (GSH) [Moron et al, 1979] и активность каталазы

(К.Ф.1.11.1.6) [Королюк и др., 1988]. В супернатантах измеряли: активность супероксиддисмутазы

(СОД, К.Ф.1.15.1.1) [Чевари и др., 1985]; конъюгирующую активность глутатиона-трансферазы (rST, К.Ф.2.5.1.18) [Habig et al, 1974]. Содержание белка определяли по методу [Bradford, 1976]. Определение биохимических показателей проводилось на спектрофотометре Lambda 25 (Perkin Elmer, США). Каждую пробу измеряли дважды.

Результаты представлены в виде средних значений и их ошибок (x±SE). Достоверность различий оценивалась методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, LSD-test, p=0.05). Статистиче­ская обработка данных проведена с помощью пакета прикладных программ Statistica 6,0 и MS Excel 2003.

Результаты и обсуждение

Выбор станций обусловлен многолетними исследованиями ряда авторов [Козловская и др., 1997; Флеров и др., 2000; Чуйко и др., 2008]. Станция Любец находится в зоне хронического ло­кального антропогенного загрязнения, тогда как станция Первомайка - в относительно чистом рай­оне Моложского плеса. При сопоставлении полученных данных о содержании ПХБ в печени рыб, обнаружились многократные различия между исследованными станциями. Эти различия относятся как к общему содержанию ПХБ, так и к содержанию отдельных групп конгенеров (табл. 1).

Таблица 1

Показатели общего содержания и отдельных групп конгенеров (по степени хлорированности) ПХБ в печени леща из разных районов Рыбинского водохранилища

Примечание: N - количество исследованных особей.

Основной вклад в общее содержание ПХБ в печени рыб на обеих исследованных станциях вносит группа пентахлорированных бифенилов. Однако, наряду с этой группой конгенеров, весомая доля от общего количества ПХБ в печени леща на станции Любец приходится на гексахлорированные бифени­лы, а в печени леща на станции Первомайка - на тетрахлорированные бифенилы (табл. 2).

Таблица 2

Вклад отдельных групп конгенеров ПХБ в общее содержание ПХБ в печени леща из разных районов Рыбинского водохранилища

Такой характер качественного и количественного содержания ПХБ указывает на разные ис­точники их поступления в данные районы водохранилища. Загрязнение Шекснинского плеса носит локальный характер, а Моложского связано с глобальным трансграничным атмосферным перено­сом. В пользу этого свидетельствует и особый гидрологический режим водоема, не позволяющий водам Шекснинского плеса попадать в Моложский плес (рис. 1). Смешение вод обоих плесов про­исходит только в Центральном плесе.

Сравнительный анализ данных по большинству исследованных биохимических параметров в пече­ни показал достоверные различия между лещами, выловленными на исследованных станциях (табл. 3).

Таблица 3

Значения некоторых параметров биотрансформации ксенобиотиков, ПОЛ и АО системы в печени ле­ща из разных районов Рыбинского водохранилища

Примечание: N - количество исследованных особей. Значения с различными цифровыми индексами, для каждого пара­метра АОС, достоверно отличаются (ANOVA, LSD тест, p=0,05).

У лещей , выловленных на станции Любец, содержание МДА в печени почти в 2 раза больше , чем на станции Первомайка. Вместе с тем у них, относительно лещей со станции Первомайка, на­блюдается низкий уровень GSH и слабая активность rST, каталазы и СОД (табл. 3). С одной сторо­ны, это указывает на высокую интенсивность образования АФК в печени рыб и, как результат, уси­ление процессов ПОЛ. С другой стороны, свидетельствует о подавленном функциональном состоя­нии АОС и ее неспособности успешно нейтрализовать АФК.

Лещи, выловленные на станции Первомайка, наряду с низким содержанием МДА и GSH ха­рактеризуются высокой активностью АО ферментов. В совокупности это позволяет говорить об ак­тивном функциональном состоянии АОС и, как результат, низком уровне АФК в печени этих рыб.

Сравнительный анализ величин биохимических показателей в жабрах рыб на исследованных станциях подтверждает данные, полученные при анализе печени лещей (табл. 4).

Таблица 4

Значения некоторых параметров биотрансформации ксенобиотиков, ПОЛ и АО системы в жабрах леща из разных районов Рыбинского водохранилища

Примечание: N - количество исследованных особей.

Соответственно тому, что содержание МДА в жабрах лещей на станции Любец несколько превышает таковое у лещей на станции Первомайка, уровни большинства АО параметров в жабрах рыб на последней станции выше, чем на станции Любец.

При изучении АОС нельзя не учитывать тканевую специфику, связанную с конкретными фи­зиологическими функциями исследуемых тканей, поскольку в разных тканях скорость процессов ПОЛ и активность ферментов АОС может различаться.

Продукты ПОЛ в печени образуются в меньшем количестве, чем в жабрах. При этом активность АОС печени отличается высокой эффективностью всех ее элементов. Полученные уровни активности каталазы и СОД свидетельствуют о том, что в клетках печени процессы ПОЛ протекают с высокой ин­тенсивностью, а указанным ферментам принадлежит ключевая роль в АО защите данной ткани. Извест­но, что печень рыб принимает участие в процессах детоксикации, аккумуляции антигенов и выведения их из организма [Микряков и др., 2001]. Высокая эффективность работы каталазы и СОД реализуется в снижении количества АФК, на что указывает относительно невысокое содержание МДА.

АО профиль жабр характеризуется большим, чем в печени содержанием продуктов ПОЛ и гораздо меньшим количеством GSH. Такой профиль АОС в жабрах, видимо, обусловлен функцией дыхания и об­мена кислородом между внешней и внутренней средой, которую они выполняют в организме рыб. По этой причине ткани жабр обладают высокой степенью насыщенности кровью, эритроциты которой имеют мощную собственную АОС. Видимо, основную нагрузку по АО защите в жабрах берет на себя АОС эрит­роцитов, где и генерируется основная часть АФК, как побочный продукт взаимодействия кислорода с ге­моглобином. АОС ткани жабр в этом процессе может играть вспомогательную роль.

Анализ полученных данных позволяет предположить, что высокий уровень содержания МДА и низкая активность ферментов АОС в печени и жабрах леща из Любца обусловлены повышенным уровнем загрязнения этого района водохранилища.

Таким образом, при сопоставлении величин показателей АОС и ПОЛ в печени и жабрах леща из 2-х районов Рыбинского водохранилища с уровнем накопления общего количества ПХБ, а также отдельных групп конгенеров, в печени леща, можно заключить, что лещ в районе Первомайки нахо­дится в более благоприятном состоянии, чем в районе Любца. Выявленные различия в состоянии АОС и ПОЛ в печени и жабрах леща на исследованных станциях хорошо соотносятся с данными о степени антропогенной нагрузки в этих районах водохранилища, что подтверждают результаты по содержанию ПХБ в печени этих рыб. Показатели АОС и ПОЛ можно использовать в качестве био­маркера для оценки состояния здоровья рыб.

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-05-00805.

Литература

Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука. 242 с.

Гостюхина О.Л., 2008. Особенности антиоксидантного статуса тканей двустворчатого моллюска

Mytilus Galloprovincialis Lam. в условиях окислительного стресса: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Симфе­рополь: Таврический национальный университет им. В. И. Вернадского. 25 с.

Довженко Н.В., 2006. Реакция антиоксидантной системы двустворчатых моллюсков на воздействие по­вреждающих факторов среды: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Владивосток: ДВГУ МОН РФ. 23 с.

Козловская В.И., Герман А.А., 1997. Полихлорированные бифенилы и полиароматические углеводоро­ды в экосистеме Рыбинского водохранилища // Вод. ресурсы. Т. 24, № 5. С. 563-569.

Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е., 1988. Метод определения активности ката­лазы // Лаб. дело. № 1. С. 16-19.

Магомедгаджиева Д.Н., 2002. Токсическое воздействие среды на некоторые показатели липидного об­мена и системы антиоксидантной защиты рыб: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Махачкала: Институт при­кладной экологии ДГУ. 23 с.

Микряков В.Р., Балабанова Л.В., Заботкина Е.А., Лапирова Т.Б, Попов А.В., Силкина Н.И., 2001. Реак­ция иммунной системы рыб на загрязнение воды токсикантами и закисление среды. М.: Наука. 126 с.

Руднева И.И., 2003. Эколого-физиологические особенности антиоксидантной системы рыб и процессов перекисного окисления липидов. // Усп. совр. биол. Т. 123, № 4. С. 391-400.

Флёров Б.А., Томилина И.И., Кливленд Л., Баканов А.И., Гапеева М.В., 2000. Комплексная оценка со­стояния донных отложений Рыбинского водохранилища // Биол. внутр. вод. №2. С. 148-155.

Чевари С., Чаба И., Секей Й., 1985. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лаб. дело. № 11. С. 678-681.

Чуйко Г.М., Законнов В.В., Герман А.В., Бродский Е.С., Шелепчиков А.А., Фешин Д.Б., Тиллитт Д.Э., 2008. Распределение полихлорированных бифенилов в экосистеме Рыбинского водохранилища при их ло­кальном поступлении // Современное состояние водных биоресурсов: материалы научной конференции, по­священной 70-летию С.М. Коновалова. Владивосток: ТИНРО-центр. С. 680-685.

Шелепчиков А.А., Бродский Е.С., Фешин Д.Б., Жильников В.Г., 2008. Определение полихлорирован­ных бифенилов и пестицидов в объектах окружающей среды и биоматериалах методом хроматомасс-спектро­метрии высокого разрешения // Масс-спектрометрия. Т.5, № 4. С.245-258.

Bradford M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principal of protein-dye binding. // Anal. Biochem. V. 72. P. 248-254.

Di Giulio R.T., Benson W.H., Sanders B.M., Van Veld P.A., 1995. Biochemical mechanisms: metabolism, adaptation, and toxicity / In: G.M. Rand (ed.) Fundamentals of aquatic toxicology. Effects, environmental fate, and risk assessment. Washington, D.C.: Taylor & Francis. Second edition. Ch. 17. P. 523-561.

Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B., 1974. Glutathion-s-transpherase: the first step in mercapture acid formation // J. Biol. Chem. V. 249. P. 7130-7139.

Mollcr P., Wallin H., Knudsen L.E. Oxidative stress associated with exercise, psychological stress and life­style factors // Chemico-Biological Interactions. 1996. V. 102. P. 17-36.

Moron M.S., Depierre J.W., Mannervik B. Levels of glutathione, glutathione reductase and glutathione s- transferase activities in rat lung and liver // Biochim. Biophys. Acta, 1979. V. 582. P. 67-78.