АДАПТАЦИИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ КРОВИ У ПРЕСНОВОДНЫХ КОСТИСТЫХ РЫБ

А.М. Андреева, И.П. Рябцева, В.В. Лукьяненко Учреждение Российской академии наук Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, п. Борок, Ярославская обл., Россия e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru Введение

Дыхание, наряду с питанием и репродукцией, относится к числу наиболее важных функций организма.

Целью работы является исследование механизмов стабилизации дыхательной функции крови на разных суборганизменных уровнях у пресноводных костистых рыб. Для этого мы изучали устой­чивость гемоглобина и эритроцитов костистых рыб к действию различных дестабилизирующих факторов.

Материалы и методы

1. Видовой состав рыб. Исследовали гемоглобины и эритроциты у пресноводных костистых рыб: щуки обыкновенной Esox lucius L., леща Abramis brama L., синца Abramis ballerus L., карася серебряного Carassius auratus L., чехони Pelecus cultratus L., плотвы Rutilus rutilus L., судака обык­новенного Stizostedion lucioperca L., берша St. volgense G., пеляди Coregonus peled G., тюльки чер­номорско-каспийская Clupeonella cultriventris N., ряпушки европейской Coregonus albula L., отлов­ленных в Рыбинском водохранилище.

2. Методы. Внеклеточный гемоглобин выявляли спектрофотометрически по поглощению сы­воротки в области Сорэ, учитывая поглощение при 410 нм трансферрина (Андреева, 1997). Для оценки структурной устойчивости гемоглобина и эритроцитов к гемолизу исследовали: 1) действие сульфата аммония на гемоглобин и переход окси-гемоглобина в мет-форму под его действием, 2) гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах NaCl и под действием кислот, 3) действие ком­плекса факторов: голодания, высоких температур, отсутствие нереста - на устойчивость гемоглоби­на и эритроцитов, 4) действие солености воды (4; 6; 8; 10; 11,5 и 20 %0) на устойчивость гемоглоби­на и эритроцитов.

1) Для оценки структурной устойчивости гемоглобина использовали метод дегидратации бел­ка под действием соли (Андреева, 1987а,б; 1997, 2006) с модификациями. Раствор гемоглобина по­мещали в раствор сульфата аммония с разным насыщением (от 5 до 100% насыщения), оставляли на 12 часов. Действие соли на белок оценивали по изменению растворимости белка и Х_макс в области полосы Сорэ. Концентрацию соли, при которой гемоглобин начинал выпадать в осадок, считали критической концентрацией преципитации - ККП (Андреева, 1997, 2006). Устойчивым считали ге­моглобин с высокой ККП, остающийся после действия соли в рабочей окси-форме с Х_макс около 412-413 нм, неустойчивым - гемоглобин с признаками структурной деградации (деструкция белка на гем и глобин, выявляемые электрофоретически), преципитирующий при низких концентрациях соли с преобладанием нерабочей мет-формы (Х_макс около 406 нм) (Андреева, 1997, 2006).

2) Гемолиз эритроцитов проводили в растворах с разным разбавлением физиологического раствора: 0,9%; 0,81; 0,72; 0,63; 0,54; 0,45; 0,36; 0,27; 0,18 и 0,09% NaCl; дист.вода. Гемолиз оцени­вали спектрофотометрически в области полосы Сорэ. Кислотный гемолиз проводили по прописи (Терсков, Гительзон, 1957).

3) Опыты по действию комплекса факторов: голодания на фоне высоких летних температур у рыб, готовых к нересту, но не отнерестившихся - проводили на выборке серебряных карасей из раз­мерной группы 12,8-15см, отловленных весной до наступления нереста в ихтиологическом канале Рыбинского водохранилища. Карасей содержали без пищи 5 месяцев в аквариумах, контрольную группу - в условиях избытка корма, вторую контрольную группу составляли рыбы из природного водоема. Микроскопические исследования клеток крови проводили на окрашенных по Романовско­му-Гимза препаратах при общем увеличении х1400. В каждом мазке анализировали не менее 500 клеток эритроидного ряда. Для получения ДНК крови последнюю смешивали с 0,5М ЭДТА рН 8,0 в соотношении 10:1 по объему, далее следовали протоколу (Mathew, 1984). Очищенную ДНК фрак­ционировали в 1% агарозе, после электрофореза окрашивали бромистым этидием (Маниатис и др., 1984). В качестве маркера молекулярной массы использовали Lambda DNA/Pst1 Marker.

4) Эксперименты по влиянию солености воды (4; 6; 8; 10; 11,5 и 20 %0) на устойчивость гемо­глобина и эритроцитов проводили на выборках сеголетков, годовичков, 2-х, 3-х, 4-х-леток леща и плотвы, полученных путем внутривидовых групповых скрещиваний на прудово-эксперименталь­ной базе Сунога ИБВВ РАН.

Концентрацию гемоглобина в растворе определяли микробиуретовым методом (Itzhaki et al., 1964) или по эмпирической кривой (Андреева, 2001), отдельных белков - с помощью программного пакета OneDscan. Электрофорез белков сыворотки, плазмы крови и гемоглобина проводили в гра­диенте концентраций ПААГ (5-40%) и SDS-ПААГ. Для определения ММ нативных молекул ис­пользовали маркеры сывороточный альбумин человека САЧ, овальбумин ОА; в SDS-ПААГ - набор PageRulerTM Prestained Protein Ladder Plus (Fermentas) маркеров с ММ 11, 17, 28, 36, 55, 72, 95, 130, 250 kDa.

Результаты и обсуждение

1. Выявление внеклеточного гемоглобина в сыворотке крови рыб. Внеклеточный гемо­глобин выявлен у всех исследованных видов пресноводных рыб за исключением щуки. Большинст­во исследованных образцов сыворотки поглощало при 406 нм, 410, 414 (или 416) нм. Поскольку трансферрин костистых рыб поглощает при 410 нм (Андреева, 1997), а при 414 (или 416) нм погло­щал очищенный эритроцитарный гемоглобин этих же экземпляров рыб, то с внеэритроцитарным гемоглобином связывали поглощение в области Сорэ при 406 нм. Таким образом, внеклеточный ге­моглобин находился в мет-форме. Несмотря на то, что сыворотки синца и карася, как правило, не имели следов гемолиза, именно у карася был отмечен случай обнаружения всего гемоглобина крови (вне- и внутриэритроцитарного) в мет-форме (см п.5).

2. Особенности структурной устойчивости гемоглобина рыб к дегидратации.

Дифференциация устойчивости гемоглобинов к дегидратации. По устойчивости гемоглоби­нов к дегидратации исследованные виды группировались в 2 основных типа - устойчивые и неус-

Рис.1. Кривые высаливания гемоглобина сульфатом аммония леща (1), судака (2), щуки (3) и тюльки (4)

1. Наиболее неустойчивым к дегидратации были гемоглобины леща и чехони. Они высаливались при 60% насыщения сульфата аммония и переходили в мет-форму при 5% на­сыщения сульфата аммония (Рис.1, 1). Несколько устойчивее были гемоглобины судака и бер- ша: их ККП=65% и при 5% насыщения соли они могли находиться в оксигенированной форме (Рис.1, 2).

2. К устойчивым относятся гемоглобины щуки и тюльки. Гемоглобин щуки может нахо­диться в оксигенированной форме при 70% насыщения сульфата аммония и выше, его ККП=70, а накануне нереста гемоглобин не высаливается (Рис.1, 3). Гемоглобин тюльки также остается в окси­форме при наличии сульфата аммония, под действием соли преципитирует по типу леща, однако, тип кривой выявляет разнокачественность гемоглобина по устойчивости к дегидратации (Рис.1, 4).

Таким образом, самый неустойчивый гемоглобин оказался у леща и самый устойчивый у щу­ки. Гемоглобины морских рыб были похожи на гемоглобин леща (имели низкие ККП и под дейст­вием соли переходили в мет-форму), несмотря на разную соленость среды обитания и тот факт, что дегидратации наиболее подвержены белки морских рыб. Наиболее устойчивыми оказались гемо­глобины пресноводных рыб - щуки, серебряного карася, а также тюльки.

Сезонные различия устойчивости гемоглобина к дегидратации. При анализе сезонной динамики ус­тойчивости белков к дегидратации гемоглобины леща и щуки показали противоположные тенденции: вес­ной накануне нереста у половозрелых лещей наблюдалось снижение устойчивости гемоглобина к дегидра­тации, осенью - рост, а у щуки весной отмечен рост устойчивости гемоглобина, а осенью - снижение.

3. Изучение устойчивости эритроцитов рыб к гемолизу под действием дестабилизирую­щих факторов.

Устойчивость эритроцитов рыб к осмотическому шоку и кислотному гемолизу. Наиболее ус­тойчивыми к осмотическому шоку оказались эритроциты тюльки: их полный гемолиз происходил в 0,09-0,18%-ном растворе Nad. У щуки, синца, карася и смариды эритроциты гемолизировали в 0,27%-ном растворе Nad. У других видов эритроциты были менее устойчивы: их гемолиз происхо­дил при 0,36 - 0,63% NaCl. Дифференциация рыб по скорости кислотного гемолиза эритроцитов практически совпадала с таковой к осмотическому шоку.

Сезонные различия устойчивости эритроцитов к осмотическому шоку. Сезонная направленность устойчивости эритроцитов в подгруппе леща и щуки совпадала - в летний период эритроциты легче гемо­лизировали, осенью были более устойчивы, что можно объяснить действием температуры воды.

Дифференциация устойчивости к гемолизу молодых и зрелых эритроцитов. У синца молодые эритроциты не гемолизировали даже в дист.воде, у леща молодые и зрелые эритроциты гемолизи­ровали при одних и тех же разведениях физ.раствора, у красноперки эритроциты были дифферен-

Рис.2.

4. Формирование устойчивости гемоглобина и эритроцитов в онтогенезе леща и плотвы. В онтогенезе леща и плотвы самым неустойчивым оказался гемоглобин сеголеток, в то время как их эритроциты были наиболее устойчивыми к гемолизу, в том числе и ки­слотному (Рис.2, 3). Таким образом, повышенная устойчивость эритроцитов компенсирует структурную нестабильность гемоглобина сеголеток, предохраняя его от дестабилизирую­щих факторов внутренней и внешней среды, что характеризует стратегию стабилизации

дыхательной функции крови в раннем развитии леща и плотвы.

Рис.3. Динамика устойчивости эритроцитов к гемолизу в гипотонических растворах NaCl (0-0,9%) плотвы: 1 - сеголетков, 2 - годовичков, 3 - двухлеток, 4 - трех-, четырехлеток и половозрелых рыб. Серой заливкой обозначена динамика устойчивости эритроцитов в летний период, темной заливкой - в осенний период

Согласованность параметров структурной устойчивости гемоглобина и эритроцитов. У поло­возрелого леща и плотвы зрелые и молодые клетки эритроидного ряда не отличались по устойчиво­сти к гемолизу, а их гемоглобины были однородны по устойчивости к дегидратации. У синца и красноперки выявлена дифференциальная устойчивость эритроцитов при одинаковых параметрах структурной устойчивости гемоглобина, у тюльки имела место разнокачественность гемоглобина по параметру его структурной устойчивости.

5. Стратегия стабилизации дыхательной функции крови рыб при неблагоприятном со­четании факторов среды. Согласование дыхательных адаптаций на разных суборганизменных уровнях мы изучали на примере серебряного карася, которого содержали в условиях неблагоприят­ного сочетания факторов. При добавлении к крови голодающих в течение 3 месяцев рыб раствора ЭДТА был зарегистрирован случай спонтанного гемолиза эритроцитов, весь гемоглобин при этом находился в мет-форме. У питающихся и остальных длительно голодающих рыб добавление ЭДТА не провоцировало гемолиз эритроцитов, Hb находился в окси- и дезоксиформе. На мазках цельной крови голодных рыб зрелые эритроциты составили около 98% от общего количества клеток эритро­идного ряда, у питающихся рыб были выявлены клетки всех стадий эритроидного ряда: около 10% составили незрелые формы, около 4% - делящиеся формы и 86 % - зрелые эритроциты.

Электрофоретический анализ тотальной ДНК из крови голодного карася, чьи эритроциты ге­молизировали, выявил апоптотические спектры деградации ДНК, у других рыб ДНК была без сле­дов фрагментации (Рис.4).

Рис.4. Горизонтальный электрофорез в агарозе ДНК из крови 1 - голодаю­щего серебряного карася: 2 - карася из водоема; 3 - маркер ММ Lambda DNA/Pst1 Marker. Вертикальная стрелка указывает направление электро­

фореза

Голодание для рыб не является экстремальным фактором, так как значительные периоды в своем жизненном цикле рыбы голодают, но, когда голодание накладывается на сезонную динамику летне-осеннего периода с высоким уровнем обменных процессов, задаваемых температурой, фак­тор голодания выступает как экстремальный дестабилизирующий. Характерные признаки програм­мируемой гибели могли быть следствием переустановки организменного гомеостаза у рыб с режи­ма перманентного эритропоэза к режиму дискретного эритропоэза и апоптоза в условиях экстре­мального сочетания факторов. Основная роль в стратегии дыхательной функции крови принадле­жит режиму эритропоэза, который зависит от питания, стадии зрелости гонад, условий прохожде­ния нереста, но зависит опосредованно - через температурные показатели воды (Солдатов, 2005).

6. Механизмы стабилизации внутренней жидкой среды рыб. Среди пресноводных кости­стых рыб у видов, имеющих быстро деградирующий гемоглобин и склонные к внутрисосудистому гемолизу эритроциты, выстроена система оперативного связывания как Hb, так и продуктов его де­градации, специализированными белками гаптоглобином, гемопексином и трансферрином, и, кроме того, неспециализированными белками - альбуминами и -глобулинами (Андреева, 1999, 2001). При связывании внеклеточного гемоглобина и продуктов его деградации эти белки проявляют пе- роксидазную активность (Андреева, 2001). В двухмерном SDS-электрофорезе на дорожках этих белков выявляются компоненты с ММ около 17 kDa, соответствующие субъединице гемоглобина (Андреева, 2001).

Выводы

Таким образом, исследование дыхательной функции крови у костистых рыб выявило разно­образие стратегий ее стабилизации. Это стратегия компенсаторного типа в онтогенезе рыб, когда структурная неустойчивость белка компенсируется повышенной устойчивость эритроцитов, это стратегия формирования разнокачественной устойчивости эритроцитов и стратегия стабилизации дыхания путем переустановки гомеостаза в экстремальных условиях, когда в дискретном режиме происходит замена всех эритроцитов. Перманентный гемолиз эритроцитов у костистых рыб не оз­начает ослабления их дыхательной функции. У костистых рыб эта особенность эритроцитов ком­пенсируется активной утилизацией внеклеточного цельного и частично деструктурированного ге­моглобина специализированными и неспециализированными белками, которые стабилизируют внутреннюю среду организма, «очищая» ее от фрагментов разрушенного белка и способствующим стабилизации дыхательной функции крови. Этот механизм стабилизации дыхательной функции от­сутствует у хрящевых рыб и хрящевых ганоидов, эритроциты которых устойчивы к гемолизу и в их крови отсутствует специализированный белок гаптоглобин, а другие белки крови также не связыва­ют гемоглобин (Андреева, 1997).

Литература

Андреева А.М., 1987а. О структуре гемоглобина некоторых видов семейства Acipenseridae // Инф.

Бюлл. ИБВВ АН СССР. №75. С.33-36.

Андреева А.М., 1987б. Устойчивость гемоглобина осетровых рыб к дегидратирующему действию суль­фата аммония // Инф. Бюлл. ИБВВ АН СССР. №76. С.56-59.

Андреева А. М. Физико-химические свойства основных групп белков крови у различных по экологии и таксономическому положению представителей хрящевых, хрящевых ганоидов и костистых рыб: Автореф. дис....канд.биол.наук. Борок, 1997. 24с.

Андреева А.М., 1999. Структурно-функциональная организация альбуминовой системы крови рыб // Вопр. ихтиологии. Т. 39.N0 6. С. 825-832.

Андреева А.М., 2001. Сывороточные пероксидазы рыб // Вопр. ихтиологии. Т. 41. №1. С. 113-121.

Андреева А.М., 2006. Влияние дестабилизирующих факторов на структурно-функциональные показа­тели гемоглобина туводных и проходных рыб // Журн. эвол. биох и физиол. Т.42. №6. С.537-543.

Андреева А.М. Структурно-функциональная организация белков крови и некоторых других внеклеточ­ных жидкостей рыб: Автореф. докт. дис.Москва, 2008. 40с.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л., 1982. Электрофорез в разделении биологических макромолекул.

М.: Мир, 448 с.

Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., 1984. Методы генетической инженерии. Молекулярное клониро­вание. М.:Мир, 480с.

Солдатов А.А., 2005. Особенности организации и функционирования системы красной крови рыб // Журнал эвол .биохимии и физиол. Т.41. №3. С.217-224.

Терсков И.А., Гительзон И.И., 1957. Метод химических кислотных эритрогамм. Биофизика, т.2. С.167-172.

Itzhaki R.F., Gill D.M., 1964. A micro- biuret method for estimating protein // Anal.Biochem. Vol.9. P.401-410.

Mathew C.G.P., 1984. The isolation of high molecular weight eukaryotic DNA // Methods in Molecular Biology/ Ed.Walker J.M.N.J.: Humana Press, Totowa. Vol.2. P.31-34.

THE ADAPTATIONS OF RESPIRATORY FUNCTION OF THE BLOOD FROM FRESHWATER BONY FISHES

A.M. Andreeva, I.P. Rjabtseva, V.V. Lukjanenko

Papanin Institute of Internal Waters Biology, Russian Academy of Sciences, Borok,

Yaroslavl Oblast, Russia, e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru

The erythrocytes of bony fishes are subjected to intravascular hemolysis, and their hemoglobins easily are destroyed to the gem and the globin. The study of these special features of the blood of bony fishes showed that the stability of the respiratory function of the blood is supported with the aid of several basic strategies: 1) compensating type strategy in the ontogenesis of the fishes, when the structural instability of hemoglobin is compensated by the increased stability of erythrocytes to the hemolysis; 2) strategy of the formation of the differential stability of erythrocytes to the hemolysis, 3) strategy of the stabilization of respiration under the extreme conditions, when for the decomposition of erythrocytes and hemoglobin is used the mechanism of apoptosis, which removes in the discrete regime of the cell of an erythroid number. The stabilization of the liquid internal environment in this case is achieved by the utilization of extracellular hemoglobin both by the specialized and unspecialized proteins, which connect noncovalently hemoglobin and products of its destruction.