ЗАНЯТИЕ 4. СЛОЖНЫЕ МЕТОДЫ ОКРАСКИ МИКРООРГАНИЗМОВ. ОКРАСКА ПО ГРАМУ
Существуют простые и сложные методы окраски, которые применяются в зависимости от целей исследования.
Сложные методы окраски основаны на особенностях физикохимического строения микробной клетки.
Сущность этих методов заключается в том, что один и тот же препарат обрабатывают несколькими красителями. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые кислото- и спиртоустойчивы, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, как, например, споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. К сложным методам окраски относятся: окраска по методу Грама, окраска спор и т.д.
Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две нетаксономические группы - грамположительные и гра- мотрицательные формы. Окраска предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом и позволяет дифференцировать бактерии, принадлежащие к различным видам, но сходные по форме и размерам.
При обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем йодом препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни бактерии также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет.
При дополнительной окраске (в частности, разведенным фуксином 1:10) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), т. е. не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий.Различие в окраске объясняется особенностями химического строения
бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для определенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин со сравнительно часто расположенными сшивками. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, который взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны).
Окраска по Граму производится следующим образом:
1. Приготовить на предметном стекле три мазка из бактериальных культур: заведомо известной грамположительной, исследуемой и заведомо известной грамотрицательной.
2. Все мазки одновременно высушить.
3. Зафиксировать мазки в пламени спиртовки.
4. Окрасить 1%-м раствором генцианового фиолетового в течение 1 минуты.
5. Краситель слить и, не промывая мазки, залить их раствором Люголя на 1-2 минуты.
6. Промыть препарат обильно водой.
7. Одновременно погрузить все три мазка в стакан с 96 % этиловым спиртом.
8. Обесцвечивание считается законченным, когда стекающие с мазка капли спирта сравняются по цвету со спиртом в стакане; обычно для этого требуется 10-30 секунд, в зависимости от толщины мазка.
9. Промыть препараты водой (при микроскопировании таких препаратов грамотрицательные бактерии бесцветны).
10. Окрасить препараты фуксином течение 1 минуты.
11. Препараты высушить и микроскопировать.
Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, гра- мотрицательные - в розовый.
При окраске по Граму необходимо точно соблюдать указанные сроки. Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вместо жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. На фиксированный мазок наносят 2-3 капли воды, на них помещают полоски окрашенной фильтровальной бумаги. Остальные этапы окраски аналогичны классическому методу Грама.
Для определения принадлежности бактерий к таксономической группе используют также экспресс-метод Грезерсона (1979). На предметном стекле в капле 3%-го раствора КОН готовится суспензия изучаемой культуры. При этом грамположительные бактерии коагулируют, а грамотрицательные образуют вязкую тянущуюся массу.
Задание
Выяснить отношение к окраске по Граму исследуемых культур методами Грама и Грезерсона.
План выполнения работы
1. Приготовить смешанную суспензию культур и окрасить методом Грама.
2. Выяснить принадлежность данных культур к группе грамположи- тельных или грамотрицательных бактерий методом Грезерсона.
3. Сделать зарисовки.
Вопросы для самостоятельного контроля
1. Какие методы окраски микроорганизмов называют сложными? Для чего они используются?
2. В чем сущность метода окрашивания бактерий по Граму?
3. Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама?
4. Какие факторы оказывают влияние на результат окрашивания по Граму?
5. Какова последовательность действий при окрашивании бактерий методом Грама?
6. Какие существуют модификации метода окрашивания по Граму?
7. В чем отличия грамположительных и грамотрицательных бактерий?
8. Какой компонент клеточной стенки является обязательным для грамположительных и грамотрицательных бактерий?
9. В чем сущность экспресс-метода Грезерсона?
10. Что значит «грамвариабельный»?