ЗАНЯТИЕ 8. ОТДЕЛ FIRMICUTES. ПАЛОЧКИ И КОККИ, ОБРАЗУЮЩИЕ ЭНДОСПОРЫ. РОД BACILLUS. МЕТОДЫ ОКРАСКИ СПОР

Группа 18 определителя Берджи представлена десятью родами и вклю­чает семейство Bacillaceae. Данная группа создана для удобства; ее таксоно­мические связи в настоящее время неясны.

Отличительная особенность бактерий - способность к образованию эн­доспор, характеризующихся высокой термоустойчивостью, непроницаемо­стью для многих красителей и дезинфицирующих веществ, устойчивостью к УФ-лучам, ионизирующей радиации, обладающих высокой светопрелом­ляющей способностью.

Внутри каждой вегетативной клетки образуется одна эндоспора, кото­

рая после созревания освобождается при лизисе клетки. Свободные эндоспо­ры метаболически не активны. В течение десятков лет они могут находиться в состоянии криптобиоза (полного покоя). В эндоспорах содержатся фер­ментные системы, обеспечивающие рост и развитие, генетический материал, благодаря чему сохраняется потенциальная способность к прорастанию и развитию вегетативных форм. Образование эндоспор часто сопровождается недостатком в среде питательных веществ, накоплением продуктов метабо­лизма и т.п., но это не ответ на неблагоприятные условия, т.к. эндоспоры час­то прорастают в той же среде, где и образовались. Это одна из форм сущест­вования вида. Наиболее интенсивно спорообразование осуществляют биоло­гически полноценные зрелые клетки, выросшие в благоприятных условиях.

Эндоспоры различных видов бактерий отличаются по размеру, форме, локализации в материнской клетке. В зависимости от этих признаков разли­чают следующие типы спорообразования:

Бациллярный тип. Споры овальные или цилиндрические, не толще материнской клетки. Расположены центрально, эксцентрально или терми­нально. Клетка имеет форму палочки. Таковы споры большинства бацилл (рис. 19).

Клостридиальный тип.

Овальные споры шире материнской клетки; они «раздувают» клетку изнутри в ходе споруляции, клетка имеет лимоновидную форму.

Плектридиальный тип.

Почти круглая спора в набухшем конце материнской клетки. Споры шире материнской клетки, поэтому она приобретает форму барабанной палочки.

Клостридиальный и плектри- диальный типы присущи в основ­ном бактериям рода Clostridium и могут одновременно встречаться в культуре одного вида.

Рис. 19. Спорообразование у бактерий рода Bacillus

Род Bacillus. Прямые палочки 0,5-2,5x1-10 мкм, с закругленными или обрубленными концами, часто в парах или цепочках. Подвижные за счет пе- ритрихальных жгутиков. Эндоспоры овальные, иногда сферические или ци­линдрические. Аэробы или факультативные анаэробы. Хемоорганотрофы с

дыхательным и бродильным типом метаболизма. Хорошо растут на простых

средах с добавлением растительного или дрожжевого экстракта, на пептон- ных средах. Они активно продуцируют различные гидролитические фермен­ты и поэтому способны использовать в качестве субстрата широкий круг ор­ганических соединений: белки, углеводы, жиры, гликозиды, спирты, органи­ческие кислоты. Могут сбраживать углеводы. Обнаруживаются в разных ме­стообитаниях, некоторые виды патогенны для позвоночных или беспозво­ночных.

Основная масса бактерий рода Bacillus является мезофилами с оптиму­мом 30-45 °С, но отдельные виды термофильные, растут при температуре до 65 °С. По строению спор и типу спорообразования мезофильные виды ба­цилл разделены на три группы.

В первую группу объединены бактерии с бациллярным типом спорооб­разования. В большинстве это аэробные и факультативно анаэробные формы, способные осуществлять брожение с образованием в качестве основных про­дуктов 2,3-бутандиола и глицерина, а также в небольших количествах мо­лочную кислоту и этанол. В этой группе выделено две подгруппы: В. subtilis (представители В. subtilis и В. licheniformis) и В. cereus (рис. 20).

Рис. 20. Вегетативные клетки Bacillus subtilis и грибовидный рост Bacillus cereus на агаре

В. subtilis - типичный представитель рода - обнаруживается повсюду в осевшей пыли. На питательных средах образует длинные цепочки, располо­женные рядами. На жидких средах растет в виде пленки. Активно расщепля­ет органические азотистые соединения (культура пахнет аммиаком). Глюкозу использует только в аэробных условиях с образованием больших количеств 2,3-бутандиола. Пышно растет на ломтиках картофеля в виде бородавчатой или пузырчатой пленки желтого или розового цвета. Споры выдерживают кипячение до 30 минут, что используется при выделении культуры.

В. licheniformis - единственный вид бацилл, который может осуществ­лять процесс денитрификации.

Бактерии подгруппы В. subtilis имеют большое значение как продуцен­ты антибиотиков субтилина и бацитрацина.

Для бактерий подгруппы В. cereus отличительным признаком является способность использовать глюкозу аэробно, а также сбраживать ее при от­сутствии кислорода воздуха. В качестве запасного вещества эти организмы образуют поли-Р-оксимасляную кислоту. Свойства бактерий подгруппы представлены в табл. 1.

Таблица 1

В. megaterium среди истинных бактерий наиболее крупный по размерам организм (до 5 мкм). Несколько меньше В. cereus; к этому виду теперь при­числяют также вариант, получивший название «mycoides» за грибовидный рост на поверхности агара (В. cereus var. mycoides). Существуют право- и ле­возакрученные штаммы, но общий вид колоний очень типичен (см. рис. 20). В близком родстве с В. cereus находятся возбудитель сибирской язвы В. anthracis, который не имеет жгутиков и окружен капсулой из глутаминовой кислоты, и патогенная для насекомых бактерия В. thuringiensis.

Для В. thuringiensis характерно образование продуктов, проявляющих энтомоцидную активность. Это три вида экзотоксинов и эндотоксин.

В соответствии с правилом называть токсины по порядку их открытия фосфолипаза С (лецитиназа С) была названа а-экзотоксином. Этот фермент вызывает распад незаменимых фосфолипидов в тканях насекомых, приводя их к гибели.

Второй токсин - Р-экзотоксин, или термостабильный экзотоксин, по­лучил свое название за сравнительно хорошую стабильность при высокой температуре: активность сохраняется при автоклавировании в течение 15 ми­нут при 121°С. В состав токсина входят аденин, рибоза и фосфор в соотно­шении 1:1:1. Действие Р-экзотоксина обусловлено ингибированием синтеза РНК.

Третий токсин - у-экзотоксин - мало изучен. Это пока неидентифици­рованный фермент (или группа ферментов). Предполагают, что он относится к фосфолипидам.

Четвертый токсин с-эндотоксин, или параспоральный кристаллический эндотоксин, образуется одновременно со спорой в противоположной части бактерии. Вначале он выглядит бесформенным комочком, постепенно пре­вращаясь в правильный восьмигранник. У большинства разновидностей В. thuringiensis образование споры и кристалла сопровождается распадом стен­ки клетки, в результате споры и кристаллы освобождаются и поступают в культуральную среду. Кристаллы по своему химическому строению пред­ставляют собой белковое соединение. Это самый активный энтомоцидный токсин. Ядовитые свойства кристаллов сказываются только в том случае, ес­ли они попадают в пищеварительный тракт насекомого.

Ферменты насекомого превращают протоксин кристалла в непосредст­венно действующий настоящий токсин. Разница в восприимчивости различ­ных видов насекомых к действию кристалла связана со специфичностью ки­шечных протеаз, контролирующих гидролиз кристаллов in vivo. Этими про­теазами обладают не все насекомые, с чем и связана избирательность дейст­вия токсина. В ЖКТ человека рН низкая, поэтому они не растворяются и не являются токсичными.

Штаммы B. thuringiensis вызывают гибель насекомых вредителей леса (в частности, сибирского шелкопряда), многих вредителей сада и сельскохо­зяйственных культур (капустной белянки, хлопковой совки и т. д.), а также некоторых видов мух. Механизм действия на организм насекомого может иметь различный характер: при развитии в организме патогенной бациллы возникает заболевание септицемия, а последействие кристалла вызывает ток­сикоз.

В настоящее время различные варианты культуры B. thuringiensis ши­роко используются для изготовления энтомоцидных препаратов (энтобакте- рин, инсектин, лепидоцид, битоксибациллин и др.). Их применение позволяет в короткие сроки уничтожить вредителей на значительных площадях без ущерба для окружающей среды.

Типичные представители бактерий второй группы - В. polymyxa и B. macerans - образуют овальные споры шире материнской клетки, которые вы­зывают ее раздувание.

Представители третьей группы - B. sphaericus и В. pasteurii. Это мик­роорганизмы с дыхательным типом метаболизма, спорообразование плек- тридиальное. Они не способны использовать углеводы, не растут на универ­стальных средах без добавления мочевины. Вид В. pasteurii известен как классический пример бациллы, разлагающей мочевину; он конститутивно синтезирует уреазу, гидролизует мочевину до СО2 и аммиака и приспособлен к высоким значениям рН. По своей физиологии с ним сходна Sporosarcina ureae, которая морфологически относится к сарцинам, но по основным фи­зиологическим признакам должна быть отнесена к бациллам (аэроб; образует терморезистентные споры, содержащие дипиколиновую кислоту). Близкий нуклеотидный состав доказывает их родственность и в генетическом отно­шении.

Бактерии рода Bacillus имеют большое практическое значение. Среди них имеются виды, нашедшие широкое применение в текстильной промыш­ленности, при получении шелка, бумаги, кофе, при выделке кож. Продуцен­ты антибиотических веществ используются в пищевой промышленности, в сельском хозяйстве. Ряд бактерий вызывают порчу продуктов, в том числе консервированных (бактерии группы сенной и картофельной палочек), мо­лочных и кулинарных изделий (B. cereus). Спороносным бактериям, особен­но их термофильным формам, отводится значительная роль в процессах са­мосогревания зерна. Многие виды обладают фитопатогенными свойствами (в основном бактерии группы картофельной палочки).

Использование терморезистентности спор для получения накопитель­ной культуры бактерий рода Bacillus

В колбу поместить 10 г измельченного сена, залить водой (100 г), за­крыть пробкой и кипятить в течение 10 минут. Затем культивировать в тер­мостате при 20-30 °С в течение 2-3 дней. На поверхности суспензии выраста­ет серо-белая пленка почти полностью состоящая из палочек B. subtilis.

Для получения накопительной культуры картофельной палочки истер­тый в кашицу картофель поместить в пробирку или колбу, прогреть на во­дяной бане при 100 °С в течение 30 минут и оставить при комнатной тем­пературе. На картофеле образуется плотная морщинистая пленка, состоящая из палочек B.mesentericus.

Задание

Ознакомиться с особенностями морфологии бактерий рода Bacillus и сложными методами окраски спор.

План выполнения работы

1. Приготовить и просмотреть прижизненный препарат бактерий рода Bacillus с окраской фуксином или метиленовым синим. При исследовании живых неокрашенных препаратов, изготовленных из старых, главным обра­зом агаровых, культур, споры чаще всего обнаруживаются в виде овальных или круглых образований, резко преломляющих свет. Зрелые споры обыч­ными растворами красок не окрашиваются. При расположении внутри клеток они видны на фоне окрашенной цитоплазмы. У спор, вышедших из клетки, окрашена только оболочка.

2. Окрасить споры по методу Ожешко или по методу Пешкова. Споры имеют очень плотную оболочку, состоящую из наружного и внутреннего слоев. Все специальные методы окраски спор основаны на действии различ­ных протрав, изменяющих структуру оболочки и тем облегчающих проник­новение в споры красящего вещества. После протравливания препараты ок­рашивают обычно карболовыми растворами красок с подогреванием мазка, последующим обесцвечиванием и дополнительной окраской. Эндоспоры очень устойчивы к простому окрашиванию, но, будучи однажды окрашен­ными, они довольно устойчивы и к обесцвечиванию.

Способ Пешкова (1924) наиболее простой и демонстративный; он не требует химических протрав и дифференцировки.

1. Приготовить тонкий мазок.

2. Зафиксировать на пламени горелки.

3. Окрасить кипящей леффлеровской метиленовой синькой (над пламе­нем спиртовки) в течение 15-20 секунд.

4. Промыть водой.

5. Докрасить 0,5 %-м водным раствором нейтрального красного в тече­ние 30 секунд.

6. Промыть водой и высушить.

Микроскопическая картина: споры голубого или синего цвета, молодые споры черно-синие, цитоплазма вегетативных форм розовая.

Способ Ожешко

1. Приготовить тонкий мазок, высушить на воздухе. Не фиксировать!

2. Обработать мазок 0,5 %-м раствором соляной кислоты, которую на­ливают в избытке и подогревают в течение 2 минут на спиртовке. Стекло держат высоко над пламенем до появления паров.

3. Остудить стекло и слить кислоту. Промыть препарат водой.

4. Окрасить мазок карболовым фуксином Циля, подогревая на неболь­шом пламени до появления паров, в течение 5 минут. Затем остудить и про­мыть водой.

5. Обработать мазок 1 %-м раствором серной кислоты в течение 2 ми­нут. Быстро промыть водой. После такой процедуры клетки бактерий обес­цвечиваются.

6. Провести дополнительную окраску спиртовым раствором метилено­вого синего в течение 5 минут, после чего обильно промыть водой и просу-

шить.

Микроскопическая картина: споры окрашиваются в красно-розовый цвет, а вегетативные клетки бактерий - в сине-голубой.

7. Сделать зарисовки.

Вопросы для самостоятельного контроля

1. Какими признаками характеризуется семейство Bacillaceae? В чем отличительная особенность его представителей?

2. Какие типы спорообразования обнаружены у бактерий родов Bacillus и Clostridium?

3. Сколько спор формируется внутри материнской клетки? Чем споры отличаются от вегетативных клеток бактерий?

4. Какими признаками характеризуется типичный представитель рода Bacillus - сенная палочка?

5. Какие биологически активные вещества синтезируют бактерии рода

Bacillus?

6. В чем заключается практическое значение бактерий рода Bacillus? Какова их экологическая роль в природе?

7. Какие представители рода Bacillus являются патогенными для чело­века?

8. Как действуют энтомопатогенные бациллы на насекомых?

Как можно получить накопительную культуру спорообразующих бак­терий?

9. Как проводится окраска спор бактерий?