Получение накопительной культуры маслянокислых клостридий
Для получения накопительной культуры обычно используют такие свойства клостридий, как способность сбраживать углеводы, анаэробность и термоустойчивость спор. Вымытый и неочищенный картофель мелко нарезают и раскладывают в физиологические пробирки на 1/3 объема, добавляют мел (для нейтрализации масляной кислоты) и заливают водопроводной водой на 3/4 объема.
Пробирки прогревают на водяной бане 15 минут при 80 °С, при этом уничтожаются вегетативные клетки и нетермостойкие споры многих микроорганизмов, а также удаляется воздух из среды. Затем пробирки закрывают пробками и культивируют при 35 °С. Через 3-5 дней ломтики картофеля всплывают, наблюдается обильное газообразование, в жидкости легко обнаруживаются бактериальные клетки с плектридиальным и клостри- диальным типом спорообразования.На картофельной среде часто выделяется C. butyricum. Для выделения других возбудителей маслянокислого брожения используют соответствующие питательные среды. Например, накопительные культуры пектиноразрушающих бактерий (C. pectinovorum, C. felsineum) получают методом Фрибе- са. Снопики из льняной соломки (или стебля крапивы) вываривают в кипящей воде в пробирке в течение 5-10 минут, чтобы удалить экстрактивные вещества. Воду сливают, снопики заливают водопроводной водой высоким слоем, кипятят 15 минут, затем охлаждают до 25-35 °С. В снопик помещают несколько соломинок льна, не подвергшихся кипячению, и культивируют при 28-30 °С. Через 3-4 суток при наличии пектинразрушающих бактерий наблюдается помутнение среды и газообразование, при этом снопик всплывает на поверхность. Для приготовления микроскопического препарата из снопика извлекают кусочек стебля и делают соскоб с поверхности скальпелем на предметное стекло в каплю воды.
Характерным свойством C. pectinovorum является накопление грануле- зы, которая располагается прерывисто. У C. felsineum гранулеза заполняет всю клетку, за исключением конца клетки, где располагается спора.
Образование масляной кислоты в среде обнаруживают по реакции с хлорнокислым железом: 5 мл культуральной жидкости переносят в пробирку, добавляют 2 мл 10%-го раствора хлорнокислого железа и нагревают до кипения.
Образующийся раствор маслянокислого железа имеет кроваво-красный цвет.Задание
Ознакомиться с особенностями морфологии бактерий рода Clostridium. Приготовить препарат с окрашенными включениями гранулезы.
План выполнения работы
1. Приготовить и просмотреть прижизненный препарат накопительной культуры сахаролитических клостридий.
2. Произвести микрохимическую реакцию на гранулезу. На предметное стекло поместить каплю культуры клостридий, добавить каплю раствора Лю- голя. Накрыть покровным стеклом и промикроскопировать. Гранулеза окрашивается йодом в фиолетовый цвет, а гликоген - в красно-бурый. Сделать зарисовки.
Вопросы для самостоятельного контроля
1. Какие продукты могут образовываться в результате маслянокислого брожения? Какие реакции ведут к образованию масляной кислоты?
2. Какие микроорганизмы осуществляют маслянокислое брожение?
3. На основании каких признаков определяется принадлежность бактерий к роду Clostridium?
4. Какие виды субстратов могут сбраживать клостридии? На какие группы делятся клостридии по данному признаку?
5. Назовите типы брожений, осуществляемых клостридиями?
6. Какие свойства маслянокислых клостридий используют при получение накопительной культуры?
7. Как можно выявить гранулезу и гликоген в клетках клостридий при микроскопировании?
8. Возбудителями каких заболеваний являются клостридии? Что лежит в основе их патогенности?
9. Какой ученый открыл анаэробный способ существования клостри-
дий?
10. Какие продукты метаболизма клостридий имеют промышленное значение?