ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА

Для определения потребления кислорода почвенными беспоз­воночными используются главным образом разнообразные мо­дификации классических объемных методов; применяются при­боры, конструкция которых основана на принципах открытой и дифференциальной манометрии (Dixon, 1941; Кожанчиков, 1961; Умбрейт и др , 1951).

Потребление кислорода у одиночных особей или групп осо­бей чаще всего измеряется манометрическим методом по Вар­бургу или Баркрофту в различных модификациях. Схемы уст­ройства респирометров на основе открытой (/) и дифференци­альной (2) манометрии предстрвлены на рис. 1. При открытой манометрии (аппарат Варбурга) система зависит от темпера­туры и атмосферного давления. Контрольные манометры (без животного в респирационном сосудике) позволяют вносить по­правку, связанную с изменением температуры и атмосферного давления в период измерения дыхания. При дифференциальной манометрии наличие компенсирующего сосудика (к) делает си­стему независимой от колебаний температуры и атмосферного давления во время измерений. Это преимущество дифференци­альной манометрии успешно используется при конструировании респирометров.

Порядок работы с манометрическими приборами состоит в следующем. В стаканчики для поглотителя СО₂ (п) помещают

138

Рис. І. Схема устройства манометрических респирометров и типы респира- ционных сосудов, удобных для работы с воздушнодышащими беспозвоноч­ными

Z — манометр Варбурга, открытая манометрия; 2 — дифференциальный респирометр Бар­крофта; 3 — типы респирационных сосудоа

о — респврацноиный, к — компенсирующий сосуды; я — манометрическая жидкость; о — нулевая отметка; л — стаканчик для поглотителя СО» (полоски фильтровальной Бумаги, опущенной в 5—20%-иый раствор щелочи)

Рис.

раствор щелочи (5—20%) и полоски фильтровальной бумаги. В респифационный сосудик помещают влажную фильтровальную бумагу й животное, в контрольные, или компенсирующие, сосу­ды— только фильтровальную бумагу. Если животное выделяет при этом секрет пахучих желез, необходимо воздух в сосудике сменить, осторожно отсасывая его с помощью груши. Сосудики прикрепляют к манометрам при открытых кранах (кр). Штати­вы с манометрами укрепляют затем на водяной бане и оставляют для выравнивания температуры и давления при открытых кра­нах на 15—20 мин. После термостатирования устанавливают манометрическую жидкость на нулевой точке и закрывают кра- ' ны. Отсчет времени измерения ведется с момента закрытия кра-

139

нов. Через определенный отрезок времени в случае открытой ма- нометрий уровень манометрической жидкости в соединенной с респирационным сосудиком ветви манометра устанавливают (при закрытом кране) на нулевой точке и записывают показания открытой ветви манометра. При дифференциальной манометрии в конце периода определения потребления кислорода записыва­ют показания обеих ветвей манометра.

Объем пптпебленного кислорода определяется по формуле:

где k — константа сосудика (цена деления манометра), h — в случае открытой манометрии высота столба манометрической жидкости (в мм) над нулевой точкой в открытой ветви маномет­ра или при дифференциальной манометрии — разность между уровнем жидкости в обеих вепрях манометра.

Методы определения константы сосудов описаны в ряде ру­ководств (Мешкова, Северин, 1950; Кожанчиков, 1961). Однако при работе с объектами разного размера достаточно знать объ­ем газового пространства сосуда и затем рассчитывать констан­ту для конкретных условий.

где V_g — объем газового пространства; К — суммарный объем добавок (объем щелочи и животного), t — температура, при которой проводится измерение. При этом возможно составление номограммы констант для данного объема газового пространства в зависимости от температуры и объема добавок.

Для измерения дыхания простейших, нематод, микроартро­под, яиц беспозвоночных применяется поплавковый микрореспи­рометр, или картезианский поплавок (Holter, 1943; Zeuthen, 1950). В отечественной литературе модель поплавкового респи- ррметра и принцип работы с ним описаны А. П. Щербаковым (1940). На рис. 2 показана схема устройства прибора, которая неоднократно видоизменялась в деталях в связи с характером объектов и целями исследования. Поплавок (рис. 2, 7) изобра­жен р рабочем состоянии: на дно помещено животное, в шейку поплавка на «определенном уровне введена капля щелочи-поглоти­теля СО_а (о), нейтрального масла (б), а оставшаяся часть тру­бочки заполнена флотационной жидкостью (б). Поплавок опу­скается во флотационную камеру. Камера и сосуд с запасом воз­духа помещаются в водяную баню. Положение поплавка реги­стрируется визуально с помощью увеличительной оптики. Объем

140

потребленного кислорода определяется по формуле.

273

273 +1 ’

где V_g — объем газового пространства поплавка; Р— изменение давления за период отсчета (в мм водяного столба), равное раз­нице показаний обеих ветвей манометра; Р_о — нормальное дав­ление, равное 10000 мм водяного столба; t — температура изме­рения. Объем Газового пространства поплавка может быть оп­ределен по объему (весу) дистиллированной воды, заполняющей поплавок до определенной метки, около которой при измерениях помещается капля щелочи, или другими указанными в руковод­ствах методами.

Манометрический метод регистрации движения поплавка мо­жет быть заменен электромагнитным (Brzin, Zeuthen, 1964; Oman, Brzin,1971). Схема устройства электромагнитного микро­респирометра приведена на рис. 3. Изменение плавучести дыха­тельной камерки (рис, 3, 6} компенсируется контролируемым изменением магнитного поля, воздействующего на магнитный поплавок (5). На этой схеме изображен картезианский поплавок, который применяют для работы с водными животными. Для воз- душнодышащих беспозвоночных он должен быть соответствую­щим образом изменен (см. рис. 2).

Для измерения дыхания мелких объектов, например яиц на­секомых, Тафт (Tuft, 1950) предложил оригинальный микроре­спирометр, который по точности измерения близок к картезиан­скому поплавку, однако имеет в сравнении с ним преимущества. В основу конструкции респирометра положен принцип дифферен­циальной манометрии (рис. 4), что делает систему независимой от температуры и атмосферного давления. Объем и устройство дыхательной (рйс. 4, 1) и компенсирующей (2) камер можно из­менять. В оригинальном описании указан объем 50—100 мм³. Камеры соединены капиллярным манометром (рис. 4, 4). Респи­рометр помещен в водяную баню. При потреблении кислорода в респирационной камере уровень жидкости в манометре смеща­ется по отношению к нулевой отметке. С помощью, пипетки, заполненной ртутыб (6) и соединенной с микрометром, положе­ние жидкости восстанавливают. Объем потребленного кислорода при этом равен показанию микрометра, умноженному на цену одного деления (в единицах объема), которая определяется пред­варительной калибровкой прибора. Прибор при относительно большом объеме рабочей камеры позволяет улавливать вмене­ние объема газа, равное 0,01 мм³. Разработана схема автомати­ческого устройства для выравнивания давления и регистрации изменения объема воздуха в дыхательной камере, однако при­бор может быть вполне использован и при ручном управлении. Относительно большой запас воздуха в камере позволяет 141

Рис.

Brzin, 1971)

1 — флотационный сосуд, ук­репленный на пластинке из оргстекла — 2, 3 — двухходо- вый манипулятор для пере­мещения пластинки с при­бором; 4 — кварцевая нить, поддерживающая респира- ционный и магнитный по­плавки; 5 — магнитный по­плавок; 6 ~ респирационный поплавок, 7 — сосуд с воз­духом, 8 — кран-отводка для насыщения флотационной жидкости воздухом, 9 — кран для выравнивания дав­ления воздушной фазы и для присоединения маномет­ра при калибровке прибора; І0 — электрическая схема; к — катушки электромагни­та. И — магнитный попла­вок (магнит в стеклянной или пластиковой ампуле)

РЙс. 4. Схема дифферен­циального мнкрйреспи- рометра (Tuft, 1950)

t — респирацнонная; г — компенсирующая камеры; 3 —краны; 4 — манометр с манометрической жидкостью 5 — нулевая отметка; 6 — мииропипетка с ртутью, 7 — резервуар с ртутью; в — ме­таллический стержень, сое­диненный с микрометром

проводить длительные измерения без опасения создать в камере дефицит кислорода.

В настоящее время при измерении дыхания воздушнодыша- щих беспозвоночных получают все большее распространение приборы с электролитической компенсацией убыли кислорода в дыхательной камере (Winteringham, 1959; Macfadyen, 1961; Бы­зов и др., 1967; Бызова, 1971; Dunkle, Strong, 1972). Преимуще­ство этого метода перед всеми перечисленными очевидно *. Здесь устранен недостаток манометрического метода, состоящий в снижении концентрации кислорода в камере в течение опыта. В респирометрах с кислородным генератором животное в тече­ние всего периода измерения дыхания находится в условиях за­данного постоянного напряжения кислорода. Большинство из имеющихся моделей таких респирометров позволяет проводить длительные измерения. Объем потребленного кислорода опреде­ляется, в зависимости от конструкции прибора, либо по уравне­нию электролиза, либо по числу стандартных порций кислорода, выделенных генератором за определенный отрезок времени.

Компенсация убыли кислорода создает преимущество этого прибора перед поплавковым микрореспирометром. Пре'имущест-

¹ Вудлеид (Woodland, 1973) показал, однако, что при длительном измерении дыхания у крупных животных в респирометре иакапЛйКаетеи значительн’о'е количество озона, оказывающего токсическое действие’на- животных. -В-ка­честве вещества, обезвреживающею озон, пригоден , нцкель-ди-п бутялди- тнокарбамат.

м

Рис. 5. Схема микрореспиро- метра с электролитической компенсацией убыли кислоро­да (Dunkle, Strong, 1972)

1 — контейнер для животного; 2 — дыхательная камера, 3 — капилляр с внутренним диаметром 2 мм; 4 — резиновые пробки; 5 — краны для выравнивания давления; 6 — шприц а — стеклянная вата; б — поглоти­тель СОг (комочки -натронной изве­сти); в — іватй; г — сеточка; Pt — платиновый электрод; Си — медный электрод; CuSO₄—насыщенный рас­твор медного купороса

во обсуждаемой модели состоит и в том, что кислород при вклю­чении генератора выделяется стандартными порциями. Однако в приборе датчиком служит замыкание цепи Pt—CuSO₄, что, как показал Макфедьен, нежелательно из-за поляризации платино­вого электрода. Кроме того, как и при открытой манометрии, точность измерения зависит от строгости термостатирования. Этот недостаток может быть устранен, если респирационную камеру переконструировать по типу компенсирующих сосудов (см. «Дифференциальную манометрию» в настоящей статье). Еще один недостаток прибора, а именно сложная система гер­метизации, может быть легко устранен путем замены резиновых пробок пришлифованными крышками.

Как уже говорилось, использование принципа дифференци­альной манометрии может практически снять проблему строгого термостатирования. В этом случае достаточным оказывается грубое термостатирование с точностью в пределах одного гра­дуса, т. е. только такое, которое исключает биологическое влия­ние изменений температуры на газообмен. На этом принципе ос­нована конструкция респирометра с электролитической компен­сацией убыли кислорода для измерения дыхания различных на­земных и почвенных беспозвоночных (Бызов и др., 1967; Бызова, 1971). На рис. 6 приведено устройство респирометра (А) и элект-

144

рических схем управления: автоматической (Б) и ручной (В). Точность измерения не зависит от атмосферного давления, так как использована схема компенсирующих сосудов, а также и от температуры, поскольку дыхательная и компенсирующая камеры выточены в едином медном или латунном блоке, выравниваю­щем в них температуру. Респирометр помещается в теплоизоли­рующую оболочку (при работе с комнатной температурой) или в специальный воздушно-водный термостат с циркулирующей в двойной стенке водой. Через кислородный генератор пропускают­ся импульсы тока длительностью 0,12 сек., благодаря чему кисло­род вырабатывается стандартными порциями. Объем порции кислорода может быть рассчитан по уравнению электролиза, а также определен объемным методом. Для этого в капиллярный ход крышки рабочей камеры (к) герметически закрепляется мик-

Рис. 6. Устройство дифференциального респирометра с электролитической компенсацией убыли кислорода (Л) и электрические схемы управления кис­лородным генератором: Б — автоматическая и В — ручная (Бызов и др., 1967; Бызова, 1971)

I — медный илн латунный блок; 2 — рабочая, 3 — компенсирующая камеры; 4 — капил­лярный манометр с каплей легкоподвижной жидкости; 5 —сосуды для поглотителя СО_г; 6 — кислородный генератор с раствором CuSO, и платиновым электродом Pt; 7 — крыш­ка из оргстекла; 8 — винты, прикрепляющие крышку к блоку, поверхность которого смазана вакуумной смазкой; 9 — капиллярные ходы для выравнивания давлення; 10 — покровные стекла, закрывающие капиллярные ходы (на вакуумной смазке); II— осве­титель

ФД— фотодиод ФД-3; Э — эксцентрик на осн синхронного мотора; С — счетчнк вклю­чений кислородного генератора

145

ропипетка, соединенная со шприцем с микроподачей и заполнен­ная дистиллированной водой. Оттягивание с помощью шприца воды из микропипетки имитирует снижение давления в рабочей камере, которое происходит при потреблении кислорода. Сниже­ние давления затем компенсируется работой кислородного гене­ратора. Таким образом несколько раз определяется объем кисло­рода, выделившегося при 50—100 включениях электролитической ячейки, откуда и рассчитывается объем единовременной порции кислорода. В сочетании с ручной схемой управлення генерато­ром (В) прибор может работать при разном напряжении в сети. Для этого электролитическая ячейка должна быть откалиброва­на при разных напряжениях. В данной схеме объем порции кис­лорода при 120 в составляет 0,24 мм³, при 190 в — 0,45 мм³. При­менение в качестве источников питания анодных батарей боль­шой емкости или аккумуляторов позволяет использовать прибор в полевых условиях. Подготовка прибора к работе состоит в следующем. Электролитические ячейки (б) в рабочей (2) и ком­пенсирующей (5) камерах заполняются равным количеством на­сыщенного раствора медного купороса. В тефлоновые стаканчики (5) на. дне камер наливают раствор щелочи. На второе дно из оргстекла кладут кусочки влажной фильтровальной бумаги, за­тем в рабочую камеру помещают животное. При открытых ка­пиллярных ходах (5) крышка (7) привинчивается к блоку, по­верхность которого покрывается вакуумной смазкой. Прибор термостатируется 5—10 мин. Капля жидкости Ів капилляре-ма­нометре (4) устанавливается у средней метки. Это можно сде­лать, слегка надавливая поочередно на капиллярные ходы крыш-' ки. Затем оба хода одновременно закрываются скользящими на вакуумной смазке покровными стеклами. С этого момента ве­дется отсчет времени измерения потребления кислорода. Объем потребленного кислорода равен объему единовременной порции кислорода, умноженной на количество включений генератора за определенный период.

Во всех перечисленных методах и приборах измерение пот­ребления кислорода, как уже говорилось, возможно лишь при полном удалении углекислого газа из дыхательной камеры. Жи­вотные при измерении потребления кислорода находятся в не­естественных условиях. Особенно это касается почвенных беспоз­воночных, для которых содержание 0,3% СО» в почвенном воз­духе— обычные условия существования, а колебания концент­рации СО₂ в почве могут зачастую иметь амплитуду в 1—2 по­рядка величин (Бызова, 1968).

Использование буферных растворов в качестве поглотителя CO₂ (Warburg, 1919; Pardee, 1949; Krebs, 1951) позволяет под­держивать в дыхательной камере некоторую .небольшую кон­центрацию углекислого газа. Для создания в камере небольшого напряжения СО₂ — от 0,03 до 0,86% Варбург предложил буфер­ный раствор, состоящий из смеси равных количеств карбоната и

146

бикарбоната натрий или калия соответствующих концентраций (Warburg, 1919):

Более высокую концентрацию СО₂ в рабочей камере — до 3—4%' можно создавать, используя в качестве буфера диэтанол­амин в чйстом виде или в смеси с другими веществами (Pardee, 1949; Krebs, 1951). Однако чистый диэтаноламин сам поглощает кислород, поэтому требуются добавки, подавляющие процесс окисления. Для этой цели применяется 0,1%-ный раствор тио- мочевийы. Одна из таких буферных смесей имеет следующий со­став: 10 мл 60%-ного раствора диэтаноламина, 3 г КНСО₃, 6NHC1 в количестве, необходимом для создания той или иной концентрации СО₂ при 38° (рис. 7), доливают дистиллированной водой до 15 мл. Затем 0,6 мл этой буферной смеси наливают в стаканчик для поглотителя СО₂ с фильтровальной бумагой *.

Изучение влияния более высокйх концентраций СО» на ды­хание почвенных беспозвоночных возможно е помощью газовой хроматографии, инфракрасного и других газовых анализаторов. Однако эти методы требуют специальной сложной аппаратуры. В сравнении с ними кажется более простым метод полярографии в газовых смесях, который стал возможен после созданий мемб­ранных электродов (Sawyer, George, Rhodes, 1959), хотя и не нашел пока широкого применения в изучении дыхания беспозво­ночных. Метод основан на измерении сопротивления платинового электрода в электролите, отделенном от газового пространства мембраной; проницаемой для кислорода (подробно см. Йса- акйн, 1Ш)- При напряжении 0,6 в на платиновом электроде ве­личина Фона, зависящего, от сопротивлений контакта'платний —. электролит, пропорциональна концентрации кислорода в гайовбй ¹ смеси дыхательной камеры.

Применение в качестве электролита агарового мостика — ра­створа электролита, приготовленного на агаре, дает возможность обходиться без мембраны. На рис. 8 приведена схема лаборатор­ной полярографической установки, примененной для определения

Буферные смеси Варбурга и Парде —Кребса рассчитаны для температуры , 25 н 38°„ соответственно". Для работы с почвенными беспозвоночными необ-.. ходимо рассчитать буферные смеси, которые позволяли бы поддерживать те же концентрации СО_г (от 0,3 до 3—4% СО₂) при температуре от 0 до 20’.. ' - ... . • • - А л

147-

потребления кислорода почвенными беспозвоночными в присутствии СО₂ (Бызова, Бызов, 1973). Электролитиче­скую ячейку в этой установке составляют каломельный (/) и платиновый (2) электроды, а электролитом служит 20%-ный раствор хлористого калия, приготовленный на агаре (агаровый

Рис. 7. Концентрация СО₂ в воздушной фазе респирацион- ного сосуда в зависимости от концентрации раствора в цент­ральном стаканчике (Pardee, 1949)

На абсциссе — количество 6NHC1 (в мл), иа ординате —»концентра­ция СОг в газовой фазе (в %)

мостик, 3). Устройство каломельного электрода (Мешкова, Севе­рин, 1950) подробно приведено на рис. 8. Платиновый электрод представляет собой платиновую проволоку диаметром 0,4 мм с изолирующим покрытием, оголенную на протяжении 3—4 мм от конца. Проволока закреплена в прямоугольно изогнутой трубке, один конец которой воронкообразно расширен, а другой имеет на наружной поверхности шлиф. Трубка заполняется горячим раст­вором хлористый калий — агар до расширенной части. После затвердения агарового мостика расширенная часть трубки за­полняется раствором хлористого калия. Выступающий конец платиновой проволоки в неглубоком желобке из тефлона также заливают агаровым раствором электролита. Трубка с помощью шлифа соединяется с измерительной камерой (4) объемом око­ло 1 см³, куда набирают пробу газовой смеси для анализа.

В отличие от схем, рекомендуемых для лабораторных поля­рографических установок (Исаакян, 1964), в данном случае при­менена мостовая схема, которая позволяет освободиться от по­стоянной составляющей электрического тока и таким рбразом использовать наибольшую чувствительность измерительного при­бора Измерительным прибором в этой схеме служит милли­вольтамперметр М-95 с чувствительностью 1-Ю^-9 ампера. Изме­рение концентрации О₂ в дыхательной камере производится од­номоментно в конце опыта. Это исключает влияние на результаты измерения дрейфа нулевой линии, который неизбежен прй высо­кой чувствительности установки.

Дыхательной камерой служит шприц, соединенный с измери­тельной камерой через трехходовый кран. Через этот же кран с

148

измерительной камерой соединяется шприц с контрольной газо­вой смесью для калибрбвки электрода. В рабочем состоянии электрод находится в равновесии с атмосферным напряжением кислорода. Газовые смеси получают разбавлением воздуха в шприцах чистым азотом или углекислым газом в определенных пропорциях Точность измерения с помощью такой установки не зависит от колебания температуры, поэтому термостатирование необходимо лишь в той мере, в какой этого требует задача иссле­дования.

Для изучения газообмена в присутствии СО₂ у почвенных жи­вотных, способных дышать в воде, могут быть исйользованы электролитические ячейки с закрытыми электродами (Камлюк,

Рис. 8. Схема полярографической установки для определения потребления кислорода почвенными беспозвоночными (Бызова, Бызов, 1973)

А — электролитическая ячейка и ресйврометр; Б — электрическая схема

/•-каломельный электрод, 2 —платиновый электрод, 3 —агаровые мостики, Ч — измери­тельная камера с отводком (а) для смены газа в ней; S — дыхательная камера с сет­кой (б), 6 — шприц с контрольной газовой смесью, 7 — трехходовый край, 8 — измери­тельный прибор

149

1967; O’Connor, 1970), полярографическая ячейка, предложен­ная для измерения дыхания нематод (Marks, Sorensen, 1971).

Определению кислорода объемными методами могут мешать различные летучие вещества, выделяемые животными. В литера­туре (Бызова, 1972) накопилось много данных о том, что почвен­ные животные выделяют, кроме секрета пахучих желез, аммиак, амины, жирные кислоты, которые не поглощаются щелочью и, оставаясь в воздухе Дыхательной камеры, маскируют истинную скорость газообмена. Например, нематоды, моллюски, дождевые черви, мокрицы, многоножки и, возможно, ногохвостки выделяют аммиак, количество которого возрастает при голодании. Во всех этих случаях при изучении газообмена манометрическими мето­дами в дыхательную камеру следует помещать специальный пог­лотитель летучих выделений, например красный лакмус — про­тив аммиака. В тех случаях, когда природа летучего вещестйа, а следовательно и поглотитель неизвестны, или поглотитель сам может испаряться, объемные методы неприменимы. Здесь могут быть использованы только такие методы, которые основаны на анализе газового состава воздуха в дыхательной камере: это, например, газовый анализатор Сколендера (Scholander, 1942), приборы с использованием газовых анализаторов (Hamilton, 1959; Bolton, 1970), газовая хроматография (Wood, Wood, Dic­kinson, 1970), полярографические установки.