МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ РАКОВИННЫХ КОРНЕНОЖЕК (TESTACIDA)

Приуроченность некоторых видов Testacida к определенным ти­пам почв, их чуткая реакция на изменение почвенных условий, выражающаяся в изменении численности и видового состава по­пуляции, а также изменении морфологического строения рако­винки, выделяет их из прочих групп простейших как благоприят­ный объект для целей почвенной диагностики (Гиляров, 1955, Bonnet, 1959, 1961, 1964).

Раковинки амеб после отмирания животного хорошо сохра­няются, особенно долго — в торфянистых почвах или заболочен­ных горизонтах, прочная раковинка тестаций позволяет приме­нять такие приемы исследования (изготовление препаратов, поч­венных срезов), при которых гибнут или становятся неразличи­мыми голые формы.

Для изучения раковинных корненожек предлагают следую­щие методы (Schonborn, 1966).

Коффман (Koffman, 1928) на предметное стекло кладет покровное, на край которого помещается небольшое количество исследуемой почвы. На нее капают несколько капель стериль­ного водного почвенного экстракта. Пространство между пред­метным и покровным стеклом действует как капилляр и затяги­вает жидкость внутрь. С ней проникают и находящиеся в почве раковинки и другие организмы (однако лишь сравнительно не­большие по размеру).

Мартин и Левин (Martin, Lewin, 1915) наливали водную почвенную суспензию в цилиндр и с помощью насоса вдували воздух. На поверхность суспензии помещали прикрепленное пластилином к нитке покровное стекло, на которое оседали ра­ковинные амебы.

При работе с торфяными почвами представляется возмож­ным «выжать» из них на стекло некоторое количество воды, содержащей Testacida. Однако при этом частично выпадают те формы, которые прикреплены к почвенным частичкам (Heal, 1967).

М. С. Гиляров (1955) приводит методику количественного учета тестаций (по Volz, 1951, с изменениями). Взятую из све­жего образца почвенную пробу объемом 0,5 см³ заливают рас­твором плазменного красителя виоламинблау в растворе фенола (по Schonborn, 1966, можно использовать витальный краситель нейтральный красный в разведении от 1 : 1 000 до 1:10 ООО; при­менимы также и другие плазменные красители), разводят в 25 раз водой и делят на 5 порций.

64

живают через мельничный газ и центрифугируют; затем воду сливают, а к осадку прибавляют равный объем глицерина. Про­сматривают 5 стекол при увеличении Х200.

В настоящее время используют прямые и культуральные ме­тоды выделения из почвы и подсчета раковинных амеб, а также метод флотационной экстракции, предложенный Боннэ и Тома (Bonnet, Thomas, 1958).

Прямое микроскопирование почвенной суспензии дает воз­можность выделить и идентифицировать раковинных амеб и учесть их количество. Для этого из образца почвы, взятого с ис­следуемой глубины, приготовляют суспензию. В зависимости от частоты встречаемости организмов, а также от количества орга­нического вещества отвешивают 100—200 мг исследуемой поч­вы, частицы опада и корни отбирают, образец заливают 20— 25 мл стерильной водопроводной воды в колбочке на несколько часов, затем встряхивают в течение 10 мин. Почвенную суспен­зию сливают в чашку Петри диаметром 10 см с плоскопарал­лельным шлифованным дном, предварительно расчерченным тонким пером тушью на квадраты по 1 см². Частицы почвы лег­ким покачиванием и с помощью препаровальной иглы равно­мерно распределяют по дну чашки тонким слоем, и взвесь про­сматривают под бинокулярным микроскопом МБС-1 в 14 квад­ратах, расположенных крестообразно по диагонали чашки. Общее количество амеб, а также отдельных видов амеб в наве­ске почвы определяется по формуле N/14XS, где N — число ра­ковинок в 14 квадратах, a S — площадь дна чашки. При анализе свежей почвы Необходимо учитывать процент влажности.

Культуральный метод при работе с простейшими применяет­ся рядом авторов (Николюк, 1956; Гельцер, 1964). Он заклю­чается в том, что небольшой образец почвы или подстилки (1 г) добавляют к стерильной среде, где развивается культура (для тестаций, учитывая их медленный рост, в течение нескольких недель).

Джонсом и Моллисоном (Jones, Mollison, 1948) была предло­жена интересная методика (стекла Джонса и Моллисона), даю­щая возможность подсчитать количество Testacida и благодаря окрашиванию выявить пропорцию живых и мертвых организмов. Почвенный образец просеивают через сито с отверстием 2 мм и отвешивают необходимое количество почвы (подбираемое так, чтобы обеспечить удобство пересчета на 1 г почвы и достаточ­ную плотность организмов в поле зрения). Почву помещают в сосуд с 5 мл стерильной дистиллированной воды и тщательно размешивают. Полученную суспензию переливают в стерильную колбу на 100 мл. В первом сосуде при этом должны остаться лишь грубые частицы песка. Взвесь затем разбавляют до 50 мл 1,5%-ным раствором агара, предварительно профильтрованным в горячем виде через бумажный фильтр. Колбу встряхивают и

3 Заказ № 4572

65

оставляют на 5 сек. для осаждения тяжелых частиц. Образец берут пипеткой непосредственно под поверхностью суспензии, переносят на стекло счетной камеры Тома, покрывают покров­ным стеклом и суспензия застывает. Затем счетную камеру по­гружают в стерильную дистиллированную воду, покровное стек­ло удаляют, лишний агар, застывший по бокам плоскости, сни­мают скальпелем. При осторожном колебании стекла в воде пленка всплывает, ее помещают на обычное предметное стекло и медленно, чтобы избежать трещин, подсушивают при комнат­ной температуре. Высушенные пленки погружают на один час в краску следующего состава: 5%-ный водный фенол—15 мл; 1%-ный водный анилинблау—1 мл; ледяная уксусная кисло­та— 4 мл. Все это фильтруют через час после приготовления. Пленки быстро промывают, обезвоживают в 95%-ном спирте и из них изготовляют постоянные препараты, которые затем про­сматривают с иммерсией, а также с использованием фазово-кон­трастной микроскопии. Подсчитывают количество раковинок в объеме наблюдаемой в поле зрения микроскопа агаризованной суспензии, которое вычисляют умножением площади поля зре­ния микроскопа на глубину счетной камеры.

Для подсчета количества и микрораспределения тестаций в почве Бэджес и Николас (Burges, Nicolas, 1961) предложили метод почвенных срезов. Толщину срезов (около 50 мк) опреде­ляли с помощью оптического приспособления к микроскопу; учитывали количество раковинок в поле зрения микроскопа, а отсюда определяли количество организмов в 1 г почвы.

Приведенные три метода — Культуральный и два прямых (стекла Джонса и Моллисона и почвенные срезы) сравнил и подробно анализировал Хил (Heal, 1964). Он ставил культуры на двух необогащенных питательных средах: к 0,5 г навески почвы или мха в чашке Петри (дм 10 см) добавляли в первом варианте — почвенную вытяжку (1 объемную часть почвы с од­ной частью воды; смесь автоклавировали, фильтровали и разво­дили 4 частями дистиллированной воды), во втором — 1%-ную агаризованную почвенную вытяжку. Культуры исследовали че­рез 1—3 и 11—12 недель. В методику Джонса и Моллисона были внесены небольшие изменения.

Количество раковинок, подсчитанное на стеклах Джонса и Моллисона, было приблизительно вдвое больше полученного методом почвенных срезов. Это объясняется, вероятно, тем, что раковинки Testacida замаскированы в срезах частицами почвы. Поэтому эта методика применима скорее для изучения микро­структуры почвы, чем для распределения и количества тестаций.

Кроме того, метод Джонса и Моллисона позволяет не только подсчитать более эффективно количество организмов, но и отли­чать мертвые клетки от живых, что необходимо для выяснения

66

биологической роли Testacida в почвах. Метод, однако, трудое­мок, так как максимально было отмечено 26 раковинок на 50 мм², причем большинство из них оказались пустыми.

Сравнительные данные, приведенные Хилом, показывают, что видовой состав раковинных амеб, обнаруженных тремя ме­тодами, не имел существенных различий. Следовательно, необо- гащенные культуры, преимуществом которых является простота

Рис.

1 — сосуд; 2 — стеклянный фильтр; 3 —трубка для подачи газа; 4, 5 и 6 — воронка с краном и коленчатой трубкой для регулирования уровня суспензии; 7, 3—©оронка и кран для добавления воды; 9, J0 — во­ронка и кран для сбора жидкости с тестаднями

и большое количество получаемых организмов, могут дать до­статочно точную картину видового состава почвенной фауны раковинных корненожек.

Однако агаризованная почвенная вытяжка благодаря своим физическим сйойствам в большей степени имитирует почвенные условия, поэтому здесь чаще встречаются' сравнительно мелкие (до 50—80 мк), уплощенные организмы типа Centropyxis и Plagiopyxis, адаптированные к почвенным условиям. В жидкой среде более часты крупные, грушевидные раковинки типа Diff- lugia, для развития которых необходимы крупные почвенные поры и высокое содержание влаги. Поэтому в -практической ра­боте следует использовать как жидкую, так и агаризованную питательные среды.

Боннэ и Тома (Bonnet, Thomas, 1958) разработали употреб­ляемый в настоящее время с небольшими изменениями (Dec- loitre, 1960) флотационный метод извлечения Testacida из почвы, основанный на продувании почвенной суспензии углекислым га­зом или воздухом. На рис. 2 приводится схема прибора, предло­женного Боннэ и Тома (по Schonborn, 1966). Почвенную суспен­зию помещают в сосуд (1), в основании которого находится крупнопористый стеклянный фильтр (2). Через трубку (3) в суспензию подают газ. Воронка (4) с коленчатой трубкой (6) и краном (5) служит для регулирования уровня суспензии. Че­рез воронку (7) в пробу при необходимости добавляют воду. Во время флотации краны (5) и (8) закрыты. Увлекаемые потоком газа раковинки концентрируются в поверхностном слое жидко­сти, которая при открытом кране (10) выплескивается в резер-

3*

67

вуар (9). По окончании флотации одновременно прекращается подача газа и закрывается кран (10). Собравшуюся жидкость переливают в чашку Петри для дальнейшего исследования.

Отфлотированную суспензию можно поместить в чашку Петри с разграфленным на квадраты дном и, зная вес почвы, пересчитать количество раковинок на 1 г почвы (Гельцер, Кор- ганова, 1974).

Куто (Coflteaux, 1967) предложила следующую методику окраски и подсчета раковинных амеб, также основанную на принципе флотации. Фиксируют 250 мг свежей почвы в 1 мл жидкости Буэна — Оллауэна в течение 1—2 дней и окрашивают в 3 мл ксилидинового красного (30 мин.). Затем суспензию раз­водят водой до 250 мл и через нее несколько часов пропускают сильную струю воздуха. Отобранные с поверхности 5 мл суспен­зии фильтруют через мембранный фильтр, который вместе с осевшими на нем раковинками заключают в канадский бальзам, где фильтр становится прозрачным и дает возможность подсчи­тать раковинки под микроскопом.

По Шардэ и Делекур (Chardez, Delecour, 1970), почвенную суспензию (5 г почвы на 100 мл воды), содержащую раковинных амеб, продувают воздухом в течение 5 мин. Для количественного подсчета раковинки собирают пипеткой с горизонтальным ка­пилляром. Из флотационной жидкости изготовляют мазки, и ко­личество тестаций подсчитывают на площади 9 мм² с помощью сеточки со стороной 3 мм; затем делают пересчет на всю навеску почвы.

Необходимо отметить, что у почвенных форм Testacida раз­меры раковинки уменьшаются по сравнению с пресноводными формами, наблюдается тенденция к микростомии (уменьшению размеров устья), развитие плагиостомии (смещение устья по плоской вентральной поверхности к переднему концу), или криптостомия (образование приустьевой камеры). У почвенных видов раковинка обычно лишена выростов — шипиков, игл, свой­ственных водным видам.

Работа с раковинными корненожками требует определенного навыка. Тонко оттянутой пипеткой раковинки под бинокуляром при увеличении 50—100 выбирают из почвенной суспейзии и по­мещают на предметное стекло. Живые организмы изучают в капле воды из той же пробы под покровным стеклом. При по­мощи препаровальной иглы, изготовленной из энтомологической булавки, осторожно двигают покровное стекло (если организм

68

крупный, оно должно быть на восковых или пластилиновых «ножках»), пока раковинка не займет нужного положения.

При длительном изучении предметное стекло с препаратом амеб помещают во влажную камеру. Если необходимо изолиро­вать животное, покровное стекло сдвигают осторожно в сторону. Рядом с капелькой, в которой оно находилось, капают другую, куда амеба осторожно переводится с помощью препаровальной иглы. Для фиксации и хранения используют 3%-ный формалин или 70%-ный спирт (Schonborn, 1966).

Систематическими признаками раковинных амеб является характер псевдоподий (их форма, величина, наличие или отсут­ствие ветвления) и строение раковинки.

Иногда приходится исследовать не свежий образец почвы, а доведенный до воздушно-сухого состояния, когда амебная клетка инцистировалась или погибла, при этом раковинка имеет для целей диагностики особое значение. Ее помещают в каплю глицерина и придают препаровальной иглой необходимое поло­жение. Если капелька достаточно мала, раковинку можно рас­сматривать и двигать под микроскопом и без покровного стекла с объективом 10^х и 20^х,

Раковинку зарисовывают или микрофотографируют по край­ней мере в двух планах — в профиль и е вентральной стороны, обращая внимание на расположение, величину и форму устья. У криптостомных видов оно лучше различимо с дымчатым филь­тром, строение раковинки с гиалиновой структурой лучше вид­но при освещении через зеленый фильтр. С помощью окуляр- и объект-микрометра измеряют диаметр и высоту раковинки и диаметр устья. Постоянные препараты приготавливаются в гли­церин-желатине. 7 г желатина в течение двух часов растворяют в 42 мл дистиллированной воды, затем прибавляют 50 г глице­рина и 0,5 г кристаллической карболовой кислоты; нагревают на водяной бане и, не дав остыть, фильтруют. Выбранные рако- вйики одного и того же вида по одной (или при достаточном опыте по несколько организмов) тонко оттянутой пипеткой или специально^- сделанной из энтомологической булавки «лопаточ­кой» переносят в свежие капли глицерина, чтобы избавиться от неизбежно попадающих частиц детрита и лишней воды, а отту­да—в глицерин-желатин. Края покровного стекла, закрываю­щего заключенный в глицерин-желатин объект (с «ножками» По углам), можно покрыть парафином или асфальтовым лаком: к 2 г расплавленного воска прибавляют 7—9 г канифоли, перед употреблением смесь подогревают (Роскин, -Левинсон, 1957). Глицерин-желатиновая среда удобна тем, что дает возможность менять положение раковинки нагретой препаровальной иглой.

При изготовлении постоянных препаратов организм (по воз­можности живой, с хорошо видимой цитоплазмой) промывают в 70°-ном спирте, после чего цитоплазму можно окрасить бор­ным кармином; затем проводят несколько раз через 90°-ный

69

спирт. Если в качестве заключающей среды используют канад­ский бальзам, перед заливкой необходима проводка через абсо­лютный спирт и ксилол. Тонкостенные формы типа Euglypha заливают каплей бальзама, предварительно подсушив их на предметном стекле.

Таким образом, работа по ознакомлению с многообразной фауной почвенных простейших для более полного представле­ния о ее составе должна включать в себя целый ряд приемов (метод разведений для жгутиконосцев и инфузорий; чашечный метод Синга — для голых амеб; прямой разбор, флотационный и культуральный методы — для раковинных корненожек), весь­ма трудоемких и требующих большой затраты времени. Единая методика, обеспечивающая проведение полного протозоологиче- скогб анализа, еще не разработана, что в значительной степени тормозит развитие почвенной протозоологии.