МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ ГОЛЫХ АМЕБ
Амебы находят более подходящие условия для своего развития на плотной питательной среде — на агаровых пластинках. Л. Б. Северцова (Sewerzowa, 1924) высевала на агаризованную среду в чашке Петри крестообразно 15 колоний В.
coli и в центр каждого крестика вносила капельку почвенной суспензии определенного разведения, в которой развивались амебы. Недостаток этого приёма — возможность передвижения амеб из одной колонии в другую. Дальнейшей разработкой его явился метод Синга, применяемый сейчас в практической работе с почвенными простейшими (Singh, 1946).Готовят 16 стерильных чашек Петри диаметром 10 см, в каждой из которых находится 8 стеклянных или пропиленовых ко-
60
лец высотой 10 мм и с внутренним диаметром 20 мм. В чашки разливают по 20—25 мл горячего стерильного агар-агара (1,5% агар-агара, 5 г NaCl, 1 г СаСО3 на 1 л воды) и распределяют кольца по краю чашки таким образом, чтобы они не соприкасались (рис. 1). После застывания агара в центр каждого кольца на агар наносят капельку густой суспензии В. coli, служащих простейшим пищ&й (2—3 см3 стерильной воды на один «косячок»
Рис. 1. Чашка Петри с кольцами (по Сингу, 1946)
1 — чашка Петри;
2 — агар-агар;
3 — стеклянные кольца;
4 — колонии В. coli
В. coli). Чашки ставят на сутки в термостат при температуре 37° для развития колоний бактерий.
10 г исследуемой почвы, подготовленной описанным выше способом, помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды, несколько минут встряхивают, дают 30 сек. отстояться. Полученная почвенная суспензия представляет собой разведение 1 : 5. Заготавливают 15 пробирок с 5 мл стерильной водопроводной воды. Из колбы с почвенной суспензией пипеткой берут 5 мл и помещают в пробирку с 5 мл стерильной воды (разведение 1 : 10).
5 мл полученной суспензии переносят в следующую пробирку (1 : 20) и т. д. — до 15-го разведения (14 пробирок и одна колба), т. е. до разведения 1 : 81 920. Из каждого разведения отдельной пипеткой вносят по одной капле суспензии на колонию В. coli в каждое из восьми колец одной чашки Петри, Каждая чашка, следовательно, соответствует одному разведению в восьми повторностях. 16-я чашка — только с В. coli ставится в качестве контрольной. Чашки помещают в термостат при температуре 22—24° на 30 дней или содержат при комнатной температуре. Через 3—4 дня просматривают кольца для обнаружения активных простейших. Для этого стерильно микробиологической петлей делают соскоб с поверхности агара внутри кольца, добавляют каплю стерильной воды и препарат исследуют под микроскопом. Кольцо, с которого начали просмотр, отмечают. При достаточном навыке можно заметить наличие амеб в кольце и под бинокуляром по «выеданию» края колонии В. coli.Количество амеб определяют, подсчитывая кольца, в которых обнаружены простейшие, и кольца без них («отрицательные» кольца) в каждом разведении. Пример такого подсчета приведен ниже.
61
| Разведения' | КолнЧесТйо колец с амебами | без амеб | Разведения | Количество колец, с амебами | бе» амеб |
| (+) | (-) | (+) | (~) | ||
| 1:5 | 8 | 0 | 1:640 | 7 | 1 |
| 1:10 | 8 | 0 | 1:1280 | 5 | 3 |
| 1:20 | 8 | 0 | Г. 2560 | 8 | 0 |
| 1:40 | 8 - | 0 | 1:5120 | 2 | 6 |
| 1:80 | 8 | 0 | 1:10 240 | 0 | 8 |
| 1:160 | 8 | 0 | 1:20 480 | О | 8 |
| 1:320 | 8 | 0 | 1:40 960 | 0 | 8 |
| 1:81 920 | 1 | 7 | |||
| Всего | +80 | -40 |
С учетом статистической вероятности, вычисленной по методу Фишера (Fischer, Yates, 1943), Синг составил таблицу, по которой определяют число простейших в 1 г почвы. По общему числу колец, где амебы не развились, находим по таблице вероятное их число (табл. 2). Для данного примера (40 «отрицательных» колец) это число равно 41 400 организмов.
Общее количество амеб суммируют из числа клеток отдельных видов. Синг определил эффективность этого метода в 64— 73%, проведя подсчет заранее известного числа амеб.
Вегетативные клетки амеб различных видов внешне не имеют существенных отличий, поэтому идентифицировать их, в особенности на агаровых пластинках, трудно. Видовому определению предшествует выделение их в чистую культуру, подробное описание вегетативных форм, стадий покоя и цист, характера движения, образования псевдоподий, состояния цитоплазмы, ядерного аппарата. В большинстве случаев необходимо приготовление постоянных окрашенных препаратов с окраской их гематоксилином.
Тщательное микроскопирование препаратов с масляной иммерсией позволяет выявить различия в состоянии интерфазного ядра.Отличать амебоидные стадии жгутиконосцев можно в висячей капле во влажной камере, где формируются плавающие стадии.
Различные исследователи вносят в методику Синга свои изменения. Так, в отношении наиболее подходящего источника пищи для амеб нет единого мнения. Синг предпочитает исполь- зойать Azotobacter. Стаут (Stout, 1962) вообще не вносит бактерий, считая, что добавление их создает благоприятнее условия для развития лишь определенных видов простейших. Автор вместо колец применяет чашечки 2 см в диаметре. В них можно поместить до 1 мл разведения, что дает возможность развиваться более разнообразной протистофауне, в особенности инфузориям.
Подбирали также оптимальные для развития всех групп простейших концентрации агар-агара. Низкие концентрации
62
Таблица 2
Определение числа простейших в 1 г почвы методом разведений (по Singh, 1946)
| 1* | 2** | 1 | 2 | 1 | 2 | 1 2 1 | 2 | ||
| 4 | »1 690 000 | 27 | 132’000 | 50 | 17 300 | 73 | 2*330 | 96 | 317 |
| 5 | ’l 430-000 | 28 | 121 000 | 51 | 15 800 | 74 | 2140 | 97 | 290 |
| 6 | 1 230 000 | 29 | 110 000 | 52 | 14500 | 75 | 1 960 | 98 | 265 |
| 7 | 1 060 000 | 30 | 101 000 | 53 | 13 300 | 76 | 1 800 | 99 | 243 |
| 8 | 931 000 | 31 | 92 000 | 54 | 12 200 | 77 | 1 650 | 100 | 223 |
| 9 | 824000 | 32 | 84 200 | 55 | 11100 | 78 | 1610 | 101 | 203 |
| 10 | 729 000 | 33 | 77100 | 56 | 10 200 | 79 | 1 390 | 102 | 185 |
| 11 | 650 000 | 34 | 70 500 | 57 | 9 380 | 80 | 1 270 | 103 | 169 |
| 12 | 581 000 | 35 | 64500 | 53 | 8 570 | 81 | 1170 | 104 | 154 |
| 13 | 520 000 | 36 | 59 000 | 59 | 7 860 | 82 | 1070 | 105 | 140 |
| 14 | 467 000 | 37 | 54 000 | 60 | 7 210 | 83 | 979 | 106 | 126 |
| 15 | 421 000 | 38 | 49 400 | 61 | 6 600 | 84 | 898 | 107 | ИЗ |
| 16 | 380 000 | 39 | 45 200 | 62 | 6 040 | 85 | 823 | 103 | 101 |
| 17 | 344000 | 40 | 41400 | 63 | 5 540 | 86 | 755 | 109 | 90,2 |
| 18 | 311000 | 41 | 37 900 | 64 | 5 030 | 87 | 693 | 110 | 79,4 |
| 19 | 282000 | 42 | 34 700 | 65 | 4 670 | 88 | 635 | 111 | 69,5 |
| 20 | 256 000 | 43 | 31 800 | 66 | 4 280 | 89 | 582 | 112 | 60,2 |
| 21 | 232 000 | 44 | 29 200 | 67 | 3 920 | 90 | 534 | 113 | 51,3 |
| 22 | 211 000 | 45 | 26 700 | 68 | 3 600 | 91 | 490 | 114 | 42,9 |
| 23 | 192 000 | 46 | 24500 | 69 | 3 300 | 92 | 450 | 115 | 34,8 |
| 24 | 175 000 | 47 | 22 400 | 70 | 3 020 | 93 | 412 | 116 | 27,4 |
| 25 | 159 000 | 48 | 20 500 | 71 | 2 770 | 94 | 377 | ||
| 26 | 145 000 | 49 | 18 800 | 72 | 2 540 | 95 | 346 | ||
* Количество «отрицателных» колец. ** Количество клеток на 1 г почвы.
(0,25%) и большое количество воды способствуют размножению цилиат, но при этом происходит взаимное заражение колец из-за миграции амеб сквозь агар.
Процесс приготовления почвенных образцов'меняется в зависимости от характера почвы. Так, встряхивания достаточно для многих минеральных почв, а количество простейших, выявляемых в опаде при его гомогенизации, увеличивается на 400% (Heal, 1967).
А. К. Лепинис (1970) предложил совместить метод Синга и метод разведений, добавляя в кольца с агаром почвенную вытяжку и учитывая одновременно амеб, инфузорий и жгутиконосцев. Число колец (повторностей) он сократил с 8 до 5.
63