Электронная микроскопия
Возможности оптических микроскопов ограничиваются не числом линз, а слишком большой длиной волны видимого света (600 нм). Объекты, диаметр которых меньше этой величины, или линии, разделенные расстоянием менее 200 нм, находятся за пределами разрешающей способности микроскопа.
Применение вместо световых волн потока движущихся электронов позволило создать электронный микроскоп (рис. 8).
Рис. 8. Электронный микроскоп
Электронный поток вызывает свечение флюоресцирующего экрана. Если на пути электронов поместить какой-то объект, то в зависимости от его плотности электроны будут больше или меньше задерживаться, соответствующие места на экране или фотопластинке окажутся более или менее затемненными. Этот простой принцип в современной электронном микроскопе дополнен принципом отклонения электронных лучей в магнитном поле подобно тому, как световые лучи отклоняются стеклянными линзами.
Источником электронного потока служит катодная лампа с вольфрамовой нитью, которая разогревается до 25000 °С.
Освобождающиеся при этом электроны летят в вакууме с большей или меньшей быстротой по направлению к аноду. В этом движении скорость определяет напряжение (30-100 кВ), существующее между анодом и катодом. Чем больше напряжение, тем выше разрешающая способность электронного микроскопа. Анод имеет в центре отверстие, через которое электроны летят по направлению к конденсору. Возле катода располагается отрицательно заряженный цилиндр, как бы суживающий пучок электронов, которые, будучи отрицательно заряжены, отталкиваются от стенок цилиндра в середину.
Это устройство в электронных микроскопах большинства систем располагается наверху, и пучок электронов направляется вниз. Объект исследования находится на их пути и отклоняет электронный луч, тем сильнее, чем плотнее его структура.
За конденсорной линзой, которая собирает электроны на исследуемом объекте. За конденсорной линзой следует объективная, промежуточная и проекционная. Затем электроны попадают на экран, покрытый светящийся под их воздействием веществами - катодолюминофорами, здесь изображение из невидимого становится видимым.Необходимый рабочий вакуум в колонне микроскопа должен быть 10-4-10-5 мм рт.ст. Изображение на флюоресцирующем экране электронного микроскопа создается тогда, когда соответствующие участки экрана будут обладать различной яркостью. При напряжение 200000 В, если препарат тонкий, можно обнаружить внутриклеточные структуры, получить увеличение до 200000 раз и увидеть объекты размером 0,002 мкм. Качество изображения в электронном микроскопе определяется его контрастом. Так как в состав биологических материалов входят в основном атомы с небольшой массой, контрастность таких материалов невелика, ее можно значительно повысить, обрабатывая препарат солями тяжелых металлов (свинца, вольфрама, урана), которые могут быть фиксированы на самом объекте (позитивное контрастирование) или использованы для повышения электронной плотности окружающего поля (негативное контрастирование). Разрешающая способность электронного микроскопа составляет 0,1-0,2 нм, а полезное увеличение - до 1-2 млн. раз.
Биологические объекты исследуются в электронном микроскопе помещенными на специальные сетки, предварительно покрытые пленками. Для их приготовления используют растворы коллодия или формвара. Основные требования к пленкам - прочность, бесструктурность, и незначительная толщина. Они должны быть легко проницаемы для электронов. Для повышения контраста биологических объектов применяют в качестве фиксатора четы- рехокись осмия (OsO4). Обычно используют 1%-ный раствор OsO4, забуфе- ренный фосфатными буферами или метод альдегидной фиксации - глютаральдегид, акролеин. Наиболее распространенным является контрастирование уранилацетатом.
Различают два типа электронных микроскопов: трансмиссионный (просвечивающий) электронный микроскоп и сканирующий (растровый) электронный микроскоп (рис.
9).
Рис. 9. Трансмиссионный и сканирующий электронные микроскопы
Трансмиссионный (просвечивающий) электронный микроскоп дает двумерное (плоское) изображение. При сканирующей (растровой) электронной микроскопии пучок электронов быстро сканирует поверхность образца, вызывая излучение, которое посредством катодно-лучевой трубки формирует трехмерное изображение на светящемся экране; этот процесс сходен с формированием телевизионного изображения. Разрешающая способность сканирующего микроскопа достигает 3 нм, увеличение - 300000. Кроме того, существуют комбинированные электронные микроскопы, которые могут работать в просвечивающем, сканирующем, либо в двух режимах одновременно. Электронная микроскопия позволяет изучить структуру микроорганизмов на макромолекулярном и субклеточном уровнях.
Задание
Научиться настраивать микроскоп и микроскопировать с иммерсионным объективом. В процессе работы с микроскопом следует учитывать наиболее распространенные ошибки:
1. Использование предметных стекол большой толщины (более 1,1-1,2 мм) не позволяет установить свет по Кёлеру (их толщина больше рабочего расстояния конденсора).
2. Применение нестандартных покровных стекол (более 0,17 мм толщины) при использовании иммерсионных объективов может привести к повреждению фронтальной линзы, при использовании сильных сухих систем
(х40) не позволяет получить изображение высокого качества.
3. Недопустимо использование суррогатов иммерсионного масла, так как их оптические характеристики могут отличаться от стандартных, что приведет к ухудшению качества изображения. Кроме того, они могут содержать агрессивные вещества, повреждающие линзы и растворяющие клей, которым эти линзы склеены.
4. Абсолютно недопустимо произвольное раскрытие апертурной ирисдиафрагмы конденсора. Полностью открытая диафрагма конденсора приводит к потере контраста, полностью закрытая - к ухудшению качества изображения (появление дифракционных ободков).
План выполнения работы
1.