Чашечный метод Коха
широко используется для определения количества жизнеспособных микроорганизмов в почве и других естественных субстратах. Применение его позволяет не только учесть численность микроорганизмов, но и оценить их разнообразие по морфологии колоний.
Почвенные образцы берут с помощью стерильной ложки, исследование проводится в день взятия образцов. Сущность метода заключается в высеве исследуемой пробы почвы на плотную среду в чашки Петри и последующем подсчете выросших колоний. При этом считают, что каждая колония является результатом размножения одной клетки. Работа проводится в три приема: приготовление разведений, посев в чашки, подсчет выросших колоний.
Посев делают из разведений суспензии в зависимости от предполага- мого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Разведения делают в стерильной водопроводной воде или изотоническом растворе хлористого натрия. В ходе опыта используют постоянный коэффициент разведения. Чаще всего делают десятичные разведения.
Образец анализируемой почвы (1-10 г) помещают в колбу со 100 мл стерильной воды и встряхивают. Затем переносят стерильной пипеткой 1 мл исследуемого материала в пробирку с 9 мл стерильной воды. Если исследуемый материал уже был разведен в 100 раз, получают разведение 1:1000. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во вторую пробирку - получают разведение 1:10000. Таким же образом готовят и последующие разведения. Степень разведения устанавливается предполагаемым количеством микроорганизмов в образце: число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Посев производят на агаризованные среды в чашки Петри. Для определения суммарной численности микроорганизмов используют мясопептонный или рыбопептонный агар (МПА, РПА), для определения содержания грибов в почве - сусло-агар (СА), для определения численности различных физиологических групп и санитарно-показательных микроорганизмов используют соответствующие питательные среды.
В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на водяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,1-0,5 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашку Петри. Данный объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим шпателем проводят по всей поверхности среды во второй и третьей чашке, куда посевной материал не вносили (метод истощающего посева).Из каждого разведения делают 4-6 параллельных высевов. При параллельных посевах одного разведения можно пользоваться одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на температуру, благоприятную для развития выявляемых организмов. Подсчет бактерий производят при культивировании с температурой 30 °С через трое суток, при комнатной температуре - через семь суток. Подсчет дрожжей и грибов - при комнатной температуре через 310 суток (при температуре 25 °С срок наблюдения за грибами может быть сокращен до 2-3 дней).
Подсчитывают количество колоний, выросших в чашке Петри, и делают пересчет на 1 г. Результаты параллельных высевов суммируют и вычисляют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, не открывая чашки Петри.
Точность метода зависит от числа подсчитанных колоний, а не от числа повторностей. Лучшим разведением считают то, при высеве из которого на плотной питательной среде от 50 до 100 колоний. Если число выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчета количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, чтобы общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения было не менее 300.
Количество микроорганизмов в 1 г (1 мл) исходного субстрата вычисляют по формуле:
T = a x b x c / d,
где T - количество микроорганизмов в 1 г, a - количество подсчитанных колоний, b - разведение, из которого произведен высев, c - 10 (если на чашки высевали 0,1 мл суспензии), d - масса субстрата (почвы), взятого для анализа
Статистическая обработка результатов возможна только при минимальной технической ошибке, поэтому чашечный метод требует большой чистоты и аккуратности при выполнении всех операций. Необходимо тщательно оберегать пипетки и среды от заражения посторонними микроорганизмами, так как случайно попавшая клетка может завысить число микроорганизмов в исследуемой суспензии. Приготовление разведений и высевы следует производить в боксе.
Описанный метод применим для учета аэробов и факультативных анаэробов. Для учета строгих анаэробов чашки Петри после посева помещают в анаэробные условия.
Экологические методы исследования почвенных микроорганизмов