Свойства липаз.
Липолитические ферменты могут действовать в очень широком диапазоне температур; например, некоторые липазы микроорганизмов активны при - 20°С [139], а фермент из семян Vernoniaanthelminthica- при 65°С.
Для обнаружения активности многих липолитических ферментов требуются продолжительные периоды инкубации. Например, используя 30 мг фирменного препарата неочищенной панкреатической липазы свиньи, за 5-15 мин можно прогидролизовать в 200 мг очищенного оливкового масла 30-50% сложноэфирных связей с первичными гидроксильными группами глицерина. Однако этот препарат представляется собой сконцентрированный источник липаз, а большинство тканевых экстрактов обладает гораздо более низкой активностью. Инкубация продолжительностью более 15 мин приводит к ацильной миграции в 1,2(2,3) - диглицеридах и 2-моноглицеридах, являющихся наиболее вероятными продуктами липолиза, с образованием из них 1,3- и 1-изомеров[140].44
Так как скорость липолиза является функцией концентрации субстрата, т.е. зависит от площади поверхности, доступной действию фермента, важно, чтобы субстрат был получен в виде максимально тонкой эмульсии. Встряхивание, перемешивание и даже воздействие ультразвуком, которое очень эффективно для диспергирования, образуются нестабильные эмульсии. Для получения стабильных эмульсий необходимо добавлять эмульгаторы. Обычно с этой целью используют гуммиарабик (из акации) в концентрации 2-10%, применяют также и поливиниловый спирт, и метилированную целлюлозу.
Хлористый натрий активирует липолиз нерастворимых триглицеридов с длинной и короткой цепью, а также гидролиз растворимых триглицеридов с короткой цепью.
Обнаруживаемые скорости ферментативного гидролиза триолеина, трибутирина, триацетина, оливкового масла все без исключения возрастают при добавлении соли. В случае триглицеридов с длинной цепью, таких, как триолеин, обнаруживаемое стимулирование панкреатического липолиза в значительной степени обусловлено наличием специфических компонентов реакционной смеси. Катионы уменьшают градиент рН на поверхности раздела и понижают кажущуюся рКа жирных кислот, которые в таком случае могут быть оттитрованы более количественно. Однако роль хлористого натрия в липолизе триглицеридов с длинной цепью не ограничивается сдвигом кривой титрования. При полном отсутствие солей липолиз не протекает, даже при рН 9, в условиях, когда хотя бы часть олеиновой кислоты оттитровывается. Можно допустить, что при отсутствии каких-либо противоионов электростатическое отталкивание полностью препятствует либо связыванию фермент-суперсубстрат, либо связыванию фермент-субстрат. Большинство липаз ингибируется ионами металлов таких как: Hg 2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Со2+ и Cu2+ [141-145]. При добавлении Са показана активация липолиза. Активация связана с удалением обладающих ингибиторными свойствами кислот с длинной45
цепью путем образования кальциевых солей. Показано, что липолиз оливкового масла начинается с той же самой скоростью независимо от того, присутствуют ли ионы Са2+ или нет, но при отсутствии ионов Са2+ реакция очень скоро замедляется. Увеличение концентрации кальция приводит к всё более линейным скоростям реакции. В принципе действие кальция немногим отличается от действия натрия или других катионов; он действует как противоион анионов жирных кислот, аккумулирующихся на поверхности раздела фаз. Но в то время как в присутствии натрия вскоре достигается равновесие и поверхность все еще остается отрицательно заряженной, в случае кальция заряд поверхности действительно погашается, так как кальциевые мыла нерастворимы [142-145]. При низкой концентрации, ниже критической мицеллярной точки и in vitro, желчные кислоты функционируют как активаторы липолиза, препятствуя разворачиванию и денатурации липазы, и устраняя блокирование поверхности раздела, масло-вода.
Специфичность. Субстратная специфичность липазы включает: 1)позиционную специфичность, т.е. способность гидролизовать в триглицеридах либо только первичные, либо и первичные, и вторичные эфирные связи; 2)стереоспецифичность, т.е. способность (гипотетическую) гидролизовать сложноэфирную связь только в положении 1 или только в положении 3 триглицерида; 3)предпочтительность к гидролизу сложноэфирных связей, образованных жирными кислотами с более длинной или с более короткой цепью, насыщенными или ненасыщенными; и в целом - зависимость скорости реакции от структуры субстрата.