Определение кинетических констант
На рис.13 приведена зависимость в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosaи проростков пшеницы от концентрации субстрата в отсутствии (прямые 1) и в присутствии хитозана (прямые 2).
ммоль -mmаммоль «мин
-2-101234-101234
ммоль'ммоль'1
Рис.13.
Графики зависимостей в обратных координатах начальныхскоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosa(а) и
проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в
присутствии хитозана (2) при рН 6,7 и 30°С.
Проекция прямых на ось абсцисс позволила определить конкурентный тип ингибирования липаз хитозаном. Найденные значения константы
107
скорости kcat, константы Михаэлиса Км и константы ингибирования К,- липаз хитозаном представлены в таблице 19.
Таблица 19.
Кинетические константы реакции гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosaи проростков пшеницы и константы ингибирования липаз хитозаном
|
Источник липазы |
Kcat, сек"1 |
Км, моль |
КСа/КМ( моль"1-сек"1 |
Kj, моль |
|
Candida rugosa |
2,0 |
6-10'4 |
3,3-103 |
1,4-10"3 |
|
Зародыши пшеницы |
0,5 |
5-Ю-3 |
1,0-102 |
0,9-10"3 |
Эффективность гидролазного действия растительной липазы на паранитрофенил пальмитат, выражаемая бимолекулярной константой kcat/KM, в 33 раза ниже, чем для липазы С.
rugosa. Это обусловлено различиями в величинах как k^t, так и Км. Величина К; грибной и растительной липаз хитозаном близки между собой и равны 1,4-10° М и 0,9-10'3 М, соответственно. Такая величина К; типична для большинства известных ингибиторов. К; панкреатической липазы человека платикодином составляет 0,2-10"3 М [239], а панкреатической липазы свиньи пропранололом - 0,6-10" М [247]. При нахождении липазы в зоне раздела липид - вода в эмульсиях эффективность связывания ингибитора с ферментом существенно увеличивалась за счет значительного преобладания открытой конформации фермента [248].С целью выяснения вклада электростатических взаимодействий положительно заряженных групп хитозана с отрицательно заряженными группами белка при образовании комплексов были изучены зависимости констант ингибирования липолитической активности хитозаном от концентрации добавленного в раствор хлорида натрия (рис.14).
Был проведен расчет числа аминогрупп хитозана, образующих ионную пару с отрицательно заряженной группой белка.
108
Kj, 10"3 моль 5-
3-
2-
0,05
ОД
0,3 [NaCl],Mlt;Mib
Рис.14. Зависимость в логарифмических координатах величин
Kj липазы C.rugosa(1) и проростков пшеницы (2) хитозаном от
концентрации хлорида натрия.
Величина п, численно равная тангенсу угла наклона прямых 1 или 2 к оси абсцисс на рис.14, имела значение 0,44 для липазы C.rugosaи 0,28 для липазы проростков пшеницы. Низкие значения величины п для обеих липаз свидетельствует о незначительном вкладе в свободную энергию комплексообразования электростатических взаимодействий зарядов хитозана и белка. С целью дополнительного подтверждения этого заключения мы провели измерения Kj грибной и растительной липаз низкомолекулярным N-сукцинил хитозаном.
Ингибирование активности липаз низкомолекулярным N-сукцинил
хитозаном
В этом производном хитозана каждая сукцинильная группа несет отрицательный заряд. Результаты измерений представлены на рис.15. Рассчитанные из этих данных К; активностей липазы C.rugosaи проростков пшеницы N-сукцинил хитозаном найдены равными 2,0-10" М и 1,7-10" М,
соответственно.
109
ММОЛЬ -MIО!ммоль «мгн
Рис.15. Графики зависимостей в обратных координатах начальных скоростей гидролиза паранитрофенил пальмитата липазой C.rugosa(а) и проростков пшеницы (б) от концентрации субстрата в отсутствии (1) и в присутствии (2) N-сукцинил хитозана при рН 6,7 и 30°С
Близость значений К; обеих липаз хитозаном со свободными аминогруппами и N-сукцинил хитозаном подтверждает вывод о незначительной роли электростатических взаимодействий при комплексообразовании хитозана с липазами, подавляющего их ферментативную активность.