Ингибирование активности липолитических ферментов моноглюкозамином
112
липолитические ферменты [243].
Представление полученных нами экспериментальных данных в координатах Лайнуивера-Берка (рис.17.) позволило определить константы ингибирования изучаемых липаз.3JS-,
в
¦6-4-202Аб
1/S. тюль'1
Рис.17. График зависимостей в обратных координатах начальных
скоростей гидролиза оливкового масла свиной панкреатической липазой от
концентрации субстрата в отсутствии (1) и в присутствии (2)
моноглюкозамина при рН 6,7 и 37°С.
Эффективность ингабирующего действия моноглюкозамина оказалась на три порядка ниже, в случае ингибирования панкреатической липазы и на два порядка ниже, в случае ингибирования растительной липазы и грибной липазы. Константы ингибирования, Kj составили 10-40 мМ (табл.21). Увеличение значений констант ингибирования связано, по-видимому, с участием в комплексообразовании с липазами только одного единственного звена моноглюкозамина. Данный вывод подтверждают найденные значения свободной энергии, AG комплексообразования моноглюкозамина с липазами.
Вклад свободной энергии, AG в комплексообразование между липазами и моноглюкозамином составил -2,32 ккал/моль для панкреатической липазы, -2,41 ккал/моль для липазы из проростков пшеницы и -2,7 ккал/моль для липазы из С. rugosa. Константы ингибирования липаз низкомолекулярным хитозаном со свободными аминогруппами составляют от 70 - 160 мкмоль, что соответствует значениям AG -5,8 ккал/моль для свиной панкреатической
113
липазы, -5,0 ккал/моль для липазы из проростков пшеницы и -5,4 ккал/моль для липазы из С. rugosa. Разница в значениях свободной энергии комплексообразования с липазами моноглюкозамина и хитозана отличается в два раза, что вероятнее всего свидетельствует о том, что при гидрофобном взаимодействии происходит связывание как минимум двух звеньев хитозана с липолитическими ферментами, а в случае взаимодействия моноглюкозамина, связывается одно единственное звено.
Таким образом, мы показали, что низкомолекулярный хитозан подавляет активность липолитических ферментов, как в гомогенных растворах, так и на границе раздела фаз. Низкомолекулярный хитозан является конкурентным ингибитором свиной панкреатической липазы, липазы из C.rugosaи липазы из проростков пшеницы.
Хитозан ингибирует специфическую активность липазы C.rugosaи проростков пшеницы в гомогенных водных растворах со значениями К; порядка 1 мМ. Константы ингибирования, Kj свиной панкреатической липазы, липазы из C.rugosaи липазы из проростков пшеницы на границе раздела фаз масло-вода, составили 77 мкМ, 152 мкМ и 114 мкМ, соответственно. При нахождении липолитических ферментов в зоне раздела фаз, липид - вода, эффективность связывания ингибитора с ферментом существенно увеличивается за счет значительного преобладания открытой конформации липаз. Величина эффекта ингибирования зависела от времени преинкубации хитозана с липазами и достигала максимума при времени преинкубации 30 мин. Хотя хитозан является поликатионом, вклад электростатических взаимодействий в его комплексообразование с липазами незначителен.Константы ингибирования многих известных ингибиторов липолитических ферментов, того же порядка, что и найденные константы ингибирования хитозаном [238-239]. Однако большинство ингибиторов применяемых для лечения избыточного веса и сопутствующих ему заболеваний обладают рядом побочных эффектов [249-250].
Хитозан благодаря наличию положительного заряда и своему строению
114
является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, низкой токсичностью и др. [15-21,25]. Это открывает большие перспективы использования низкомолекулярного хитозана в качестве ингибитора липолитических ферментов для профилактики и лечения нарушений липидного метаболизма и сопутствующих ему заболеваний в составе биологически активных добавок.
115