Хроматографический анализ хитозана.
Для определения антибактериальной активности экстракта
64
выделенного из восковой моли использовали штамм M.smegmatis134-S. Бактерии выращивали на мясо-пептонном бульоне в колбах на качалке (100 об/мин) в течение 72 часов, при температуре 37°С. Для определения чувствительности микобактерий (процент гибели) в пробирки вносили тестируемую фракцию экстракта (из расчета ОД мг/мл белка) и
о
ресуспендировали в изотоническом растворе NaCl до титра ~ 10 кл/мл. Реакционную смесь инкубировали в течение 1,5 часов при 37°С на качалке. Методом титрования определяли количество выживших клеток и рассчитывали процент их гибели.
Антибактериальная активность хитозана в отношении штаммов М. aviumи М. bovis
Штаммы М. aviumи М. bovisиспользовали для определения чувствительности (гибели клеток) к действию образцов хитозана с Мг| 38 (СД 78%), 58 и 87 кДа (СД 80% и 84%, соответственно) и N-сукцинил хитозана с Мг| 380 кДа, в концентрации ОД %. Для этого готовили ОД % раствор хитозана (рН 6,8) и добавляли его к питательной яичной среде, после чего, коагулировали при температуре 90°С в течение 60 минут.
Затем высевали 0,5 мл микробной суспензии на чашку Петри с питательной средой содержащей хитозан или без хитозана (контроль). Посевы с клетками М. aviumкультивировали в течение 14 дней при температуре 37°С, а посевы с клетками М. bovisв течение 28 дней при температуре 37°С.Определение МИК хитозана в отношении клеток М. smegmatis
Для определения МИК каждый образец хитозана титровали методом двукратных серийных разведений в полистирольных планшетах - ряд из 12 лунок. Начиная со второй лунки, вносили по 100 мкл стерильного изотонического раствора NaCl. В первую пустую лунку вносили 100 мкл исходного 1%-ного хитозана. Таким образом, начиная со второй лунки, 100 мкл хитозана с определенной концентрацией разводили до конца ряда (двукратными разведениями); из последней лунки 100 мкл смеси удаляли. Далее готовили микробную суспензию из расчета 5х 10 кл/мл (стандарт № 5
65
ГИСК им. Л.А. Тарасевича). В каждую лунку ряда вносили 10 мкл микробной суспензии. Использовали 12 опытных и 2 контрольные лунки. В качестве первого контроля служила смесь из 100 мкл изотонического раствора NaCl и 10 мкл микробной суспензии. Второй контроль содержал 100 мкл 1%-ного раствора хитозана без добавления микробной суспензии.
Планшеты со смесью разведенных образцов хитозанов с тест-культурой инкубировали в течение 4 часов при 37°С, и затем высевали на чашки Петри с МПА. Параллельно, делали высевы на чашки Петри и из контрольных лунок. После инкубации учитывали наличие или отсутствие роста М. smegmatisпри соответствующих разведениях тестируемых образца хитозана. Определение прочности связывания хитозана с поверхностью клеточной стенки М. smegmatisпроводили в супернатанте с помощью колориметрического метода при длине волны 565 нм на спектрофотометре «Specol-11» («Carl Zeiss Jena», Германия). Метод основан на взаимодействии основных аминогрупп хитозана с нингидрином. В качестве контроля использовали раствор из контрольного варианта опыта [129].