Гидролиз высокомолекулярного хитозана.
58
внеклеточный хитинолитический комплекс, продуцируемый S.kurssanovii: гидролиз проводили при температуре 45°С, рН 5,3 [203]. Количество культуральной жидкости необходимое для гидролиза рассчитывали по суммарному белку, содержание которого составляло 0,410 мг на мл культуральной жидкости.
- промышленный ферментный комплекс Целловиридин Г20х на основе штамма Trichoderma viride: гидролиз проводили при температуре 55°С, рН 5,3 [204] Расчет количества препарата вели исходя из содержания белка 3,7%.
- папаин из латекса дынного дерева Carica papaya L.: гидролиз проводили при температуре 37°С, рН 4,0 [117]. Расчет количества фермента вели исходя из содержания белка 70%. Для полной активации фермент предварительно растворяли в 1 мл дистиллированной воды, содержащей 5 мМ L-цистеина и 2 мМ ЭДТА.
Для ферментов используемых в процессе гидролиза, фермент-субстратное весовое соотношение составляло 1/400 (весовое отношение содержания белка в препарате к весу субстрата). Гидролиз высокомолекулярного хитозана осуществляли в течение 3 ч, отбирая аликвоты через определенные промежутки времени. Остановку гидролиза проводили кипячением в течение 10 мин. В каждом образце определяли количество восстанавливающих Сахаров. Образцы гидролизованные в течение 3 ч, дополнительно диализовали против воды, лиофильно высушивали и определяли СД и Mw.
Получение экстракта из восковой моли, Galleriamellonella
Личинки восковой моли промывали изотоническим раствором NaCl. После чего, к личинкам добавляли изотонический раствор NaCl в соотношении 1:5.
Гомогенизировали при 1200 об/мин в течение 10 мин и центрифугировали при температуре 4°С, на 3000 об/мин. Липидную пробку после центрифугирования прокалывали иглой Дюфо и отбирали супернатант. Хранили супернатант при температуре 4°С.59
Определение хитиназной активности. Хитиназную активность определяли по количеству восстанавливающих Сахаров по реакции с 3,5-динитросалициловой кислотой, используя в качестве субстрата коллоидный хитин. К 0,5 мл суспензии коллоидного хитина (концентрация 10 мг/мл) добавляли 0,5 мл 0,1 М Na-фосфатного буфера рН 6,4 и 0,5 мл фильтрата культуральной жидкости. Смесь инкубировали 15 мин при 37°С, после чего останавливали гидролиз прогреванием в течение 5 мин при 100°С. Далее фуговали 15 мин при 5000 об/мин, отбирали 0,25 мл надосадка, добавляли 0,25 мл DNSA и инкубировали в течение 5 мин при 100°С. Затем добавляли 2 мл холодной воды и проводили измерение оптической плотности на приборе «Specol-11» (Германия) при Х,=582 нм. Активность рассчитывали по формуле:
А= показание прибора • 3/0,11 • 0,22 • 15 (мкмоль/мин-мл);
где 15 - время реакции (мин);
0,11 - коэффициент прибора;
0,22 - молекулярный вес N-ацетил-В-глюкозамина;
3 - разведение реакционной среды.