1.6. Антибактериальная активность хитозана
Уровень антибактериальной активности хитозана зависит от вида микроорганизма, размера молекул хитозана, концентрации препарата в растворе, рН, температуры, источников хитина и хитозана, типа модификации [106,112-115].
Помимо этого, антибактериальное действие хитоолигосахаридов сильно зависит от СД и СП, то есть Мл, и для его проявления необходимы олигомеры глюкозамина со СП не менее 6 [116]. В свою очередь величина СД и Мг| хитозана зависят от условий их получения. Хитозаны с низкой СП и с высокой СД наиболее эффективны как антибактериальные агенты [117].
Известно, что клеточная стенка грамположительных бактерий состоит из толстого пептидогликанового слоя, располагающегося с наружной стороны клеточной мембраны. Пептидогликаны построены из
37
повторяющихся звеньев: GlcNAc и N-ацетилмурамовой кислоты. Кроме того, молекула пептидогликана содержит остатки тейхоевой кислоты [118], в состав которой входят повторяющиеся звенья глицерина и адонита. Поскольку звенья тейхоевой кислоты, соединенные с D-аланином пептидогликана через фосфатный мостик, несут отрицательный заряд, то их наличием, отчасти, объясняется отрицательный заряд поверхности клетки в целом. Клеточная стенка грамотрицательных бактерий состоит из тонкого слоя пептидогликанов и фосфолипидного двойного слоя с наружной стороны клеточной мембраны [119]. Присоединенные к наружному фосфолипидному двойному слою липиды, и полисахариды образуют специфические липополисахаридные структуры.
Так как этот наружный фосфолипидный слой имеет гидрофильную фосфатную группу, несущую отрицательный заряд, клеточная поверхность любой грамотрицательной бактерии в целом оказывается заряженной отрицательно. Таким образом, поверхность клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов имеет отрицательный заряд.Протонированные NH2 группы хитозана способны взаимодействовать с анионными группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонентами бактериальной поверхности [120]. Количество положительно заряженных NH2 групп хитозана увеличивается с увеличением СД. Следовательно, хитозан с большей СД проявляет наибольшую сорбционную и антибактериальную активность [121]. Однако следует учитывать, что количество отрицательного заряда на поверхности бактерий может меняться в зависимости от штамма [122]. Кроме того, комплексообразование хитозана с бактериями зависит от Мг| и концентрации полимера, уровня рН и ионной силы растворов [123,124]. Так же оно возможно за счет диполь-дипольных взаимодействий; водородных и гидрофобных связей и
38
зависит от плотности заряда (конформации цепей), соотношения времени их взаимодействия и температуры [122].
В большинстве работ, посвященных исследованию антибактериальных свойств хитозана, изучаются высокомолекулярные производные [125,126]. Исследование антибактериальной активности растворов хитозана с Мг| 160кДа в концентрации 0,5% против Е. coliи S. aureus, показало, что для проявления антибактериального эффекта в отношении Е. coliбыло достаточно концентрации 0,0375%). МИК для Е. coliи S. aureusсоставила 0,375 мг/мл и 0,15 мг/мл, соответственно [127].
Однако в основном используют хитозан, растворенный в уксусной или соляной кислоте [125,126]. Например, Tsai G.-J. [122] и Червинец В.М. [128] показали, что 1%-ные растворы хитозанов с Мл 26-600 кДа и СД 75-85%, в 0,2%-ной соляной кислоте, оказывают антимикробное действие на многие микроорганизмы.
Однако следует отметить, что применение в качестве растворителя хитозана кислот само по себе вызывает гибель исследуемых микроорганизмов [122,128], что искажает истинные показатели выживаемости клеток при их обработке хитозаном [129].Важным абиотическим фактором, влияющим на активность хитозана, является рН [31]. При рН ниже 6 аминогруппы при С-2 глюкозаминных остатках молекулы хитозана лучше взаимодействуют с отрицательно заряженной поверхностью бактериальной клетки [122,130]. Вместе с тем известно, что антибактериальная активность ограничивается плохой растворимостью хитозана при рН более 6,5 [112].
Изучение влияния значений рН на степень антибактериального воздействия хитозана показали, что в кислых условиях (рН 5,8) антибактериальная активность была максимальной при низкой концентрации препарата. Kumar В.А [117] показал, что антибактериальная активность хитозанов была обратно пропорциональна действию рН (испытывали рН 4,5-5,9). Наибольшая активность была обнаружена при низких значениях рН. Рядом авторов так же сообщается, что
39
антибактериальный эффект увеличивается с увеличением температуры и уменьшением рН (130). Дело в том, что при рН 5,3-5,5 хитозан протонирован. При таком значении рН карбоксильные и фосфатные группы поверхности бактерий несут отрицательный заряд, вследствие чего возникает возможность их электростатического связывания с хитозаном. При нейтральном рН хитозан протонирован намного меньше (рКк 6,3) и его связывание с внешней мембраной клетки менее вероятно [120].
Было показано, что при низких концентрациях хитозан соединяется с поверхностью клеточной стенки, разрушает клеточную мембрану и вызывает гибель клетки с вытеканием наружу внутреннего содержимого клетки [112]. При высоких концентрациях хитозан связывается с поверхностью клеточной стенки, но препятствует вытеканию внутриклеточных компонентов [107]. Meyer Н. с соавторами [131] использовали хитозаны в концентрации 0,5-2,5% при рН 5,5 против Streptomycesaureus, Е.
coli, Yersiniaenterocolitica, Listeriamonocytogenesи Salmonellatyphimurium. Исследуемые образцы при данной концентрации вызывали гибель всех вышеперечисленных микроорганизмов. Однако хитозан в концентрации менее 1% не влиял на рост S. aureus, Pseudomonasaeruginosaи Candidatropicalis. К сожалению, в данной работе авторы не указали значений Мг| и СД исследуемых препаратов, что необходимо для полного понимания и объяснения причин гибели микроорганизмов.Tsai G.-J. с соавторами [120] исследовали влияние СД на антибактериальную активность хитозана. Оказалось, что с увеличением СД хитозана от 53 до 98% увеличивался его антибактериальный эффект. Было изучено влияние хитозана в отношении патогенного штамма Clostridiumperfringesи 13 штаммов пробиотиков, включая 7 штаммов Lactobacillusи 6 штаммов Bifidobacterium. Была обнаружена корреляция между увеличением СД хитозана от 50 до 95% и усилением антибактериального воздействия хитозана на клетки микроорганизмов.
40
Хитозан с СД 50% обладал меньшей активностью, чем полимер со ,СД 95%. Morimoto L. и Shigemasa Y. изучали ингибирование бактериального роста хитозанов с СД от 66 до 91%. В их работе так же подтвердилось, что с увеличением СД усиливается антибактериальный эффект [106]. Sekiguchi S. показал, что хитозаны с Мг| 3,1 кДа и СД 52%, и Мп 7,4кДа и СД 45% проявляли слабую антибактериальную активность против В. cereus. Процент гибели клеток составил 58% и 74%, соответственно. Активность зависела от Мг| и СД образцов [117]. Myoung H.S. с соавторами [132] изучали влияние катионов на связывание низкомолекулярного хитозана (Мг| 3 к Да, СД 95%) с поверхностью бактериальных клеток S. aureusи Е. collКлетки подвергали воздействию СаСЬ, а затем обрабатывали хитозаном. В итоге, количество хитозана, связанного с клетками, уменьшилось. Клетки S. aureusобладали большим эффектом связывания с ионами Са . Этот результат показывает, что число отрицательно заряженных остатков на поверхности клетки уменьшилось, вследствие их связывания с ионами Са2+.
Тем не менее, катионный характер не является единственным определяющим фактором антибактериальной активности хитозана [133]. В своей работе Cuero R.G. [120] показал, что мутантный штамм S. tuphimurium, имеющий на своей поверхности положительный заряд, был намного устойчивее к воздействию хитозана, чем исходный штамм. Однако электронно-микроскопические исследования показали, что хитозан, тем не менее, вызывает деформацию поверхности бактериальных клеток, а их внешняя мембрана обретает везикулярную (пористую) структуру.Изучение времени взаимодействия хитозана и клеток бактерий показало, что процесс связывания хитозана и клеток занимает несколько минут [132]. Далее клетки подвергли воздействию детергентов (Твин 80 и Тритон Х-100) в концентрации 0,5%. Результаты показали, что на клетках S. aureusколичество хитозана незначительно уменьшилось, а на клетках E.coliнет. Между тем известно, что обработка клеток EDTA и детергентами
41
вызывает повышение проницаемости их внешней мембраны [120]. Так, при изучении антибактериальных свойств хитозана против Е. coliв среду добавляли EDTA, что вызывало увеличение гибели клеток [113]. Тем не менее, существуют микроорганизмы, устойчивые к воздействию агентов, вызывающих проницаемость внешней мембраны - S. typhimurium, Proteusmirahilis, Bacteroidesfragilis[133].
Известно, что бактерии более чувствительны к хитозану, чем грибы. Показано, что фунгицидная активность хитозана более выражена при концентрации 0,5-5,0 мг/мл и низких значениях рН (рН~6) [118,111].
Изучение антибактериальных свойств хитозан-лактатов с Мг| 0,5; 5кДа и 1,2 кДа против Saccharomycesbayanusи Saccharomycesunisporusпоказали, что хитозан-лактат с Мл 5кДа оказывал более сильный эффект по сравнению с препаратом с Мп 0,5кДа [134]. Хитозан-лактат 1,2 кДа не обладал антибактериальными свойствами в отношении изученных микроорганизмов. Это можно объяснить тем, что антибактериальная активность хитозана уменьшается с увеличением Мл, [106].
Микроскопическое исследование обработанных хитозан-лактатом клеток Sac. unisporusY-42 показало аглютинацию хитозана на клеточной стенке микроорганизмов, что говорит о взаимодействии между хитозаном и клеточной стенкой бактерий [134]. Tsai G.J. [122] изучал антибактериальные свойства гидролизата хитозана, состоящего из низкомолекулярного хитозана 12 кДаи хитоолигосахаридов (СП 1-8). Хитозан 12 кДа проявлял высокую антибактериальную активность в концентрации 100 мкг/мл против В. cereus, Е. coli, S. aureus, Ps. aeruginosa, SalmonellaentericaserovarTyphiи Saccharomycescerevisiaeв то время как хитоолигосахариды обладали существенно меньшей активностью.