3.4.2. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гетерогенных растворах, на границе раздела фаз
Зависимости начальных скоростей гидролиза оливкового масла липазами от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствие ингибитора описываются уравнением Михаэлиса-Ментен, после линеаризации, которого в координатах Лайнуивера-Берка были определены максимальные скорости гидролиза и константы Михаэлиса Кт.
На рис.16 показана зависимость обратной начальной скорости гидролиза оливковогоПО
масла свиной панкреатической липазой от концентрации субстрата в отсутствие и в присутствие хитозана. Аналогичные зависимости получены и для липазы из проростков пшеницы и для липазы из С. rugosa.
Рис.16. График зависимостей в обратных координатах начальных
скоростей гидролиза оливкового масла свиной панкреатической липазой от
концентрации субстрата в отсутствии (1) и в присутствии ингибитора (2)
при рН 6,7 и 37°С.
Проекция прямых на ось абсцисс позволила определить, что хитозан является конкурентным ингибитором липолитических ферментов. Найденные из этих зависимостей значения молекулярных констант скорости, kcat и констант Михаэлиса, Кт представлены в таблице 20.
Таблица 20.
Кинетические константы реакции гидролиза оливкового масла липолитическими ферментами
|
Фермент |
Кт, моль |
Кса^сек |
"-cat'K-m» моль'-сек"1 |
|
Панкреатическая липаза свиная |
0,24«10'3 |
19,4 |
8Ы03 |
|
Candida rugosa |
0,27-Ю-3 |
1М |
42,2«103 |
|
Из проростков пшеницы |
0,2*10"3 |
1,7 |
8,5 «103 |
Эффективность гидролазного действия панкреатической липазы на оливковое масло, выражаемая бимолекулярной константой кса/Кт, в 10 раз
111
выше, чем для растительной липазы, и в 5 раз выше, чем для липазы из С.
rugosa. Разница в эффективности гидролазного действия на субстрат между
панкреатической липазой и липазой из С.
rugosaсоставляет около двух раз.Это обусловлено различиями в величинах как kcat, так и Км.
Из данных табл. 21 следует, что низкомолекулярный хитозан ингибирует
липолитическую активность, константы ингибирования Kj изменяются в
пределах 70-160 мкМ, в зависимости от ингибируемого фермента.
Таблица 21. Константы ингибирования липолитических ферментов
низкомолекулярными хитозанами и моноглюкозамином
|
Фермент |
Константы ингибирования Kj, моль |
||
|
Хитозан |
N-сукцинил хитозан |
Моноглюкозамин |
|
|
Панкреатическая липаза свиная |
7,7-10'5 |
1,М0"5 |
4,3«10"2 |
|
Candida rugosa |
1,52-Ю"4 |
3,3-10"4 |
1,М0"2 |
|
Из проростков пшеницы |
1,14»10"4 |
4,2» 10"4 |
0,36-10'2 |
Значения констант ингибирования растительной липазы и липазы из С. rugosaодного порядка. Константа ингибирования хитозаном панкреатической липазы на порядок ниже и составила 77 мкМ. Увеличение констант ингибирования хитозаном растительной и грибной липаз по сравнению с константами, найденными при гидролизе водорастворимого субстрата, согласуется с данными о том, что при нахождении липолитических ферментов в зоне раздела фаз, липид - вода, эффективность связывания с ингибитором существенно увеличивается за счет значительного преобладания открытой конформации фермента.