3.4.1. Ингибирование активности липолитических ферментов хитозаном в гомогенных водных растворах
Подбор оптимальных параметров ферментативной реакции в гомогенных водных растворах В результате изучения влияния Мт| хитозана от 5-94 кДа на степень ингибирования активности липазы из С.rugosa, было показано, что максимальное снижение активности наблюдалось при действии хитозана с молекулярной массой 6 кДа и менее (таблица 18). В дальнейших исследованиях мы использовали хитозан с Мт| порядка 5-6 кДА. Полученные результаты согласуются с литературными данными, полученными Tsujita Т., о том, что хитозан с Мг| 10 кДа ингибирует активность панкреатической липазы лучше, чем хитозан с Мт|46 кДа [243].
104
Таблица 18.
Зависимость значений констант ингибирования липазы C.rugosaот молекулярной массы ингибитора
|
Мл хитозана, кДа |
К|,МОЛЬ |
|
94 |
1,4 |
|
56 |
0,5 |
|
23 |
2,540 "2 |
|
15 |
8«10_3 |
|
6 |
1,2*10 "3 |
Для оптимизации условий измерения констант ингибирования липаз хитозаном первоначально оценивали оптимальное время преинкубации фермента и ингибитора перед началом ферментативной реакции.
Известно, что в растворах молекула липазы C.rugosaимеет две конформации [244]. В одной из них активный центр фермента закрыт пептидным фрагментом молекулы, а в другой - открыт, что делает его доступным для связывания субстрата и других лигандов. В водных растворах липаза находится преимущественно в неактивной конформации с закрытым активным центром. При нахождении липазы в зоне раздела липид - вода ее активность резко возрастает за счет изменения равновесия между двумя конформациями в сторону значительного преобладания открытой конформации. Предполагается, что ингибиторы липазы C.rugosaвзаимодействуют преимущественно, если не исключительно, с открытой формой фермента и что любые переходы между этими двумя конформациями фермента в растворе являются медленными [245]. Поэтому время установления концентрационного равновесия в растворе липазы после добавления ингибитора будет определяться характеристическим временем перехода между закрытой и открытой конформациями фермента. На рис.11 представлены зависимости активности липазы C.rugosaи проростков пшеницы от времени преинкубации с хитозаном до добавления в реакционную смесь субстрата.Время преинкубации варьировали от 5 до 120 мин. Степень
105
ингибирования обеих липаз зависела от времени преинкубации вплоть до 30 мин, после чего оставалась примерно постоянной. Поэтому далее величина времени преинкубации соответствовала 30 мин.
я
Я
.Sл
о
S
Л
о
я
00
я о
9
ст
о
сг
0,0015 0,001
St
Я
Я
0 5 10 20 30 40 60 80 120 Время преинкубации, мин
Рис.11. Зависимость ферментативной активности липазы C.rugosa(1) и проростков пшеницы (2) от времени преинкубации с хитозаном при рН 6,7
иЗО°С
На рис.12 показана зависимость активности липазы C.rugosaи проростков пшеницы от величины рН.
п
Ч
я н о
16,5 14,5
12,5
из
g10gt;5 1
я
Я 8'5
нlt;; 6,5
4,5
1111111
5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5
рн
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
gt;
s и я о о н
О
н я Ь
Рис.12.
Зависимость ферментативной активности липазы C.rugosa(1) и проростков пшеницы (2) от рН реакционной смеси при 30°СМаксимальная активность ферментов при использовании в качестве
106
субстрата паранитрофенил пальмитата достигалась при рН 6,7. Такое же значение рН - оптимума было найдено ранее для липазы из C.rugosaпри изучении кинетики гидролиза в водных растворах оливкового масла [246].
Последующие измерения константы ингибирования обеих липаз были выполнены при рН 6,7.