3.3.2. Фракционирование экстракта восковой моли
99
отношении М. smegmatis, а также специфическую липолитическую активность, предполагая, что за антибактериальную активность ответственны гидролитические ферменты.
Таблица 17.
Фракционирование экстракта выделенного из восковой моли
|
Стадии очистки |
V, мл |
Белок, мг |
Аудел* ед./мл |
As |
Выход А а% |
Очистка, А |
Аантиб*» % |
|
Экстракт без липидов |
11 |
15,4 |
0,053 |
0,836 |
100 |
1 |
14 |
|
45% сульфат аммонийный высол |
10 |
3,9 |
0,061 |
0,24 |
29 |
1,2 |
9 |
|
Гидрофобная хроматография на бутил-тойоперл |
9 |
0,68 |
0,165 |
0,11 |
13 |
3 |
21 |
|
МХАХ на тандеме Ni(II)- ИДКСи(Н)-ИДК- агарозе |
8 |
0,3 |
1,36 |
0,38 |
45 |
29 |
38 |
Необходимо отметить, что значения липолитическои активности коррелируют со степенью антибактериальной активности.
Нами была поставлена задача, получить из экстракта восковой моли фракцию, обладающую максимальной антимикробной активностью в отношении тест-культуры М.
smegmatis.Первоначально нами была проведена экстракция этилацетатом, позволяющая отделить липиды и липопротеиды от экстракта. Липидная фракция в отличие от водной, не проявляла антибактериальной активности, а наоборот стимулировала рост клеток микобактерий, вероятно, выступая в качестве дополнительного питательного компонента.
Далее водная фракция экстракта освобожденного от липидных составляющих была подвержена сульфат аммонийному высаливанию со степенями насыщения 30%, 45%, 60% и 85%. Из полученных фракций максимальной антибактериальной и липолитическои активностью обладала фракция, выделяемая 45% насыщением сульфатом аммония. Эта фракция была подвержена хроматографической очистки. Первая стадия очистки
100
была проведена на колонке с гидрофобным сорбентом бутил-тойоперл. Выбор колонки был обусловлен тем, что в гидрофобной хроматографии сорбцию проводят в присутствие сульфат ионов. Поэтому отобранную после сульфат аммонийного высаливания фракцию наносили на колонку уравновешенную 0,05 М Na-фосфатным буфером, содержащим 0,9 М сульфата натрия. После нанесения и промывания уравновешивающим буфером белки элюировали в ступенчатом градиенте концентрации 0,3 и 0,1 М сульфата натрия.
Учитывая, что одностадийное фракционирование редко позволяет получить высокую степень очистки, мы планировали проведение следующей стадии очистки - металл-хелат аффинной хроматографии. Так как в металл-хелат аффинной хроматографии использование аммонийных ионов нежелательно, хроматографию на колонке бутил-тойоперл проводили в присутствии сульфата натрия. Фракция с максимальной липолитической и антибактериальной активностью, элюировалась на гидрофобной колонке в буфере с сульфатом натрия в концентрации 0,1 М.
Предварительно было изучено хроматографическое поведение полученной с гидрофобной колонки фракции на иминодиуксусной (ИДК)-агарозе заряженной ионами Cu(II) и Ni(II). Было показано, что белки с максимальной антибактериальной и липолитической активностями не обладают сродством к иммобилизованным ионам Ni(II), но при этом сорбируются на ИДК-Си(П) агарозе и элюируются при добавлении в буфер 0,05 М имидазола.
Известно, что на ИДК-колонках заряженных ионами Си(И) сорбируются белки, имеющие хотя бы единственный поверхностно экспонированный остаток His, в то время как для сорбции на ионах Ni(II) требуется наличие в молекуле белка сближенных остатков His во вторичной и третичной структуре, способных образовывать координационные связи с ионами металлов.Учитывая, что на №(П)-ИДК колонке сорбировалась часть балластных белков, следующую стадию очистки было решено проводить в тандеме
101
колонок на №(11)-ИДК-Си(П)-ИДК агарозе, в режиме on-line. Для
предотвращения ионообменных взаимодействий в буфер добавляли 0,2 М NaCl. После нанесения белка и промывки, колонки рассоединяли. С Cu(II)-ИДК колонки элюцию проводили последовательным добавлением 0,05 М и 0,25 М имидазола. Фракция элюированная с добавлением 0,05 М имидазола обладала максимальной липолитической и антибактериальной активностью. Суммарная очистка экстракта после стадии сульфат аммонийного высаливания составила 1,5 раза, а после двух хроматографических стадий очистки - гидрофобной и металл-хелат аффинной степень очистки составила 29 раз.
В результате проведенного фракционирования получить фракцию, содержащую индивидуальный белок, обладающую антибактериальной активностью, не удалось. Однако была получена фракция с высокой степенью очистки содержащая набор белков с различными молекулярными массами (рис. 10).
Рис. 10. SDS-электрофорез в 12%-ном ПААГ. Окраска брилиантовым синим R-250. Обозначения: 1 - Экстракт без липидов и липопротеидов; 2-фракция полученная 45% высаливанием (NH^SO^ 3 - маркерные белки с молекулярной массой (кДа): 21, 31, 45, 66, 97; 4 - фракция элюированная с гидрофобной колонки в буфере с 0,1 М Na2SO,i; 5 - фракция элюированная с гидрофобной колонки в буфере с 0,3 М Na2S04; 6 - фракция элюированная с Cu-ИДК колонки в буфере с 0,05 М имидазола; 7 - фракция элюированная с Cu-ИДК колонки в буфере с 0,25 М имидазола
Таким образом, в результате последовательного фракционирования экстракта восковой моли была получена фракция, обладающая
102
максимальной антибактериальной активностью в отношении атипичного штамма М. smegmatis. Показано, что с увеличением антибактериальной активности росла и специфическая липолитическая активность. На основании полученных данных можно сделать заключение, что за антибактериальную активность экстракта ответственны вещества белковой природы, в том числе и липазы. Эти ферменты, способны разрушать некоторые жизненно важные для микобактерий липиды и другие содержащие сложноэфирные связи, видоспецифические молекулы, что могло привести к гибели бактерий, в результате повреждения липидного слоя клеточной стенки.