3.1.4. Ферментативный гидролиз

В данной работе проводилось изучение гидролиза хитозан-меланинового комплекса личинок восковой моли с помощью трех различных ферментных препаратов, обладающих и не обладающих хитинолитической активностью. Гидролиз хитозана из личинок восковой моли осуществляли с использованием ферментов:

1. Хитинолитического комплекса ферментов S. kurssanovii, в котором присутствуют хитиназы с молекулярной массой 42,38,26,20 кДа [224].
2. Промышленного ферментного препарата Целловиридин Г20х на основе штамма T.viride. В данном препарате содержатся целлюлазы, Р-глюканазы и ксиланазы [225].
3. Протеолитического фермента папаина (ЕС 3.4.22.2) из латекса дынного дерева (CaricapapayaL.). Папаин является цистеиновой эндопротеазой и гидролизует пептидную связь [226].

Гидролиз хитозана из кутикулы личинок восковой моли проводили в оптимальных условиях, описанных для каждого ферментного препарата в литературе [117,227]. Основное отличие в проведение процесса касалось   фермент-субстратного   соотношения.   В   результате   анализа

85

литературных   данных   мы   остановились   на   соотношении   -   1/400.

Гидролиз проводили в интервале времени от 0,25 до 3 ч. Эффективность

гидролиза              определяли              по              накоплению              образующихся

восстанавливающих Сахаров в процессе гидролиза с использованием

реагента на основе динитросалициловои кислоты.

количества   восстанавливающих   Сахаров   в   зависимости   от   времени

гидролиза представлены в таблице 14.

Таблица 14.

Влияние продолжительности гидролиза на образование восстанавливающих Сахаров

Согласно полученным результатам, под действием данных ферментных препаратов гидролиз протекал с различной степенью интенсивности..

86

частичной потерей хитиназной и особенно хитозаназной активностей в условиях гидролиза. Обычно имеет место потеря около 50% активности ферментного комплекса через 1 час гидролиза. В случае ферментного комплекса T.viride50% инактивация гидролаз и целлюлаз происходила через 3 часа. Что же касается медленного накопления восстанавливающих Сахаров в процессе гидролиза папаином, то это можно объяснить неспецифичностью субстрата. Их накопление в последующие два часа гидролиза составляло всего 15-20%.

Таким образом, из полученных результатов следует, что хитинолитический комплекс S. kurssanoviiнаиболее эффективен для проведения гидролиза хитозан-меланинового комплекса. В таблице 15 приведены физико-химические свойства полученных гидролизатов.

Таблица 15. Физико-химические свойства высоко- и низкомолекулярного ХзМК

Молекулярную массу полученных в результате гидролиза образцов хитозана определяли методом гель-проникающей высокоэффективной жидкостной хроматографии. В большинстве работ, характеристика хитозана обычно сводится к определению средневязкостной молекулярной массы. Для полимера, существующего в виде смеси разных по длине молекул, такая характеристика недостаточна, поскольку не даёт представления о молекулярно-массовом распределении молекул хитозана в образце. Структурная неоднородность хитозана может являться фактором, влияющим на его свойства и проявляемую им биологическую активность.

87

При изучении биологических свойств хитозана, большая полидисперсность образца будет затруднять интерпретацию экспериментальных данных, в связи с тем, что биологический эффект хитозана может определяться минорной долей молекул с молекулярной массой, значительно отличающейся от средней величины молекулярной массы. В нашем исследовании полученные индексы полидисперсности (Ip=Mw/Mn) не превышали значений 1,2-1,8, что свидетельствует об относительной однородности полученных гидролизатов по молекулярной массе.

Выход гидролизатов менее 55% можно объяснить тем, что при гидролизе хитинолитическим комплексом S.kurssanoviiиз-за высокой СД (89%) и следовательно, лучшей растворимости при рН 5-6 возможны ощутимые потери низкомолекулярных фракций (lt; 10 кДа) при диализе; а при гидролизе комплексом T.viride, скорее всего, из-за большого количества образующихся моносахаров, которые также теряются во время диализа. Именно этим можно обосновать относительно высокую молекулярную массу получаемого гидролизата (96,4 кДа).

Для получения водорастворимого при нейтральных значениях рН низкомолекулярного хитозан-меланинового комплекса целесообразно использовать ферментный комплекс S.kurssanovii, но он является менее доступным по сравнению с Целловиридином, коммерческим препаратом, разрешенным к использованию в качестве кормовой добавки к рационам сельскохозяйственных животных.

На основе проведенных исследований мы определили оптимальные условия каждой стадии схемы переработки кутикулы личинок восковой моли. Учитывая все особенности сырья, мы предлагаем  схему переработки кутикулы личинок  восковой моли с

88

получением таких веществ, как хитин-меланиновый комплекс, высокомолекулярный и низкомолекулярный хитозан-меланиновые комплексы. Данные условия переработки в основном нацелены на получение ХзМК, который может найти новые области применения. Следует отметить, что, варьируя параметрами технологического процесса, можно изменять физико-химические свойства продуктов в зависимости от целей использования. Например, менее жесткие условия депротеинирования позволят наряду с ХМК получать из гидролизата белок-меланиновый комплекс с сохранением нативных свойств и возможностью использования в качестве кормового продукта.